撰文 | 觉主在路上
责编 | 兮
细胞是组成人类个体的基本单位，因其生长环境、遗传背景等因素的不同而构成了不同的个体，进而形成个体差异。每个个体的不同表现形式被称作为表型（Phenotype），它是个体基因型与其环境相互作用而产生的一系列特性进行分类的一种方式。因此，了解和分析组成个体的所有单个细胞的生活轨迹，比如它们是如何发育生长、在不同个体之间存在的差异、在疾病过程中的具有怎样的功能障碍，对于人们对人类细胞表型以及个体差异的理解具有重要的意义。近年来，单细胞基因组学（Single-cell genomics）因为其能够提供大量检测方法及高通量数据而备受重视。
2019年9月27日，来自瑞士巴塞尔分子与临床眼科研究所负责人J. Gray Camp和瑞士苏黎世联邦理工学院的Barbara Treutlein教授在Science的Genotype to Phenotype特刊上共同撰文Mapping human cell phenotypes to genotypes with single-cell genomics，总结了如何将单细胞基因组学应用于人类表型的研究。
1、单细胞表型分析策略
人类表型分析的大体策略是从单个细胞开始，在分子水平上分析其状态，进一步整合至每种组织、整个系统水平，由此对个体进行表型总结。因此，单个细胞状态的分析就成为了重中之重，而单细胞测序技术（Single-cell sequencing technologies）为此提供了可能。单细胞测序技术能够同时检测上千种细胞中每种细胞的上千种特征，能够对每个细胞特征进行量化。目前的技术手段能够在单个细胞中实现对RNA表达、DNA测序、甲基化状态、染色质结构及可接近性和蛋白质组成进行检测分析【1】。除了检测单细胞的这些分子特征，单细胞测序技术还能够帮助进行细胞正常和疾病状态的谱系示踪【2,3】。除此之外，还可通过使用RNA杂交技术、蛋白质免疫组织化学技术、原位测序、质谱等技术对单细胞空间转录组、蛋白组学等信息进行补充。将这些技术进一步整合至组织当中，可以对组织和器官内不同区域以及不同阶段的的细胞特征进行分析【4】，即在时间和空间上都能够检测细胞状态。当整合这些单细胞信息之后，细胞表型可以被总结分类，从而获得细胞表型信息。这种通过单细胞测序方法整合从单细胞水平到组织系统水平的一系列整合分析从而获取细胞表型信息的方法则为单细胞表型分析（single cell phenotyping），其优势是能够将细胞形态和分子水平特征相结合，帮助对细胞类型进行分类，追踪细胞状态和谱系，从空间和时间上对组织内细胞异质性进行深层次分析。2. 单细胞表型分析在疾病研究中的应用
单细胞表型分析不但能够应用于正常细胞、组织器官内，更重要的是在疾病发生发展过程中的应用，它能够帮助人们理解基因改变是如何参与疾病发生发展的。疾病相关的诊断通常是检测自然发生的基因突变，这些基因突变能够引起特定的一些细胞表型的变化，而人们则将具有这一类的表型变化的疾病人群归类，定义为由此基因突变而导致的表型变化【5】。通过这种方法，将基因型与特定人群表型想关联。最典型的例子是研究人员在人肺部发现一种新型的细胞群（ionocyte），这群细胞在肺纤维化过程中高表达CFTR（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator），因此被认为在肺病变过程中具有重要功能【6】。但是，目前最大的问题在于，大部分与疾病相关的特定基因尚未被发现，而单细胞表型分析方法能够极大地促进疾病相关基因的发现和表型分类。除了发现新特性的细胞群，单细胞表型分析也可以发现特定表型组织内一类细胞的功能，比如阐述肌萎缩性侧索硬化症内空间胶质神经元的相互作用【7】。目前，通过这种方法鉴定出的细胞类型对于临床诊断和治疗疾病具有很大帮助。然而，目前面临的最大困难在于如何更好的优化这些实验手段，使其能够更好地应用于临床，如怎样能够通过获取最少的组织，操作过程中最大限度减少细胞损失，而获得最多的有用信息【8】。3. 单细胞表型分析与类器官和基因编辑方法的联合
类器官是在由干细胞分化生长而成的能够在体外进行3D培养的结构【9】。通过单细胞基因组技术分析后发现，这些体外培养的类器官能够高度还原体内健康组织和疾病状态下组织器官的细胞状态，包括分子水平和表型【10】。单细胞基因组技术为类器官提供有力的证据，使其被认为是在体外模拟个体组织发育和疾病发生发展过程中最好的研究工具。比如最近的研究发现，体外脑类器官培养能够在体外重塑人体内发现的神经元迁移缺陷，这将很大程度地解决体内组织材料稀缺以及体内研究过程中难以操作地问题【11】。此外，脑类器官也可以应用于在缺氧条件下特定细胞类型或状态的鉴定，从而针对这些疾病相关细胞状态或表型进行小分子药物筛选，以阻止这种细胞的出现【12】。总的来说，将多种单细胞基因组学分析手段和类器官技术相结合，能够很好的纪律细胞历史和进行3D空间信息重塑，为个体化治疗策略提供更好的分型和治疗策略。CRISPR/Cas9编辑方法使得在体外培养的细胞株和类器官培养体系中有效的基因编辑成为可能 【14】。目前结合基因编辑和单细胞分析技术的主要类型可分为四类。正向遗传学方法，已知致病基因，对致病基因进行一定的编辑，进而对下游表型变化进行分析；反向遗传学方法，主要通过CRISPR筛选基因（pooled CRISPR screens）技术与单细胞测序技术相结合，将CRISPR gRNAs靶向成百上千个不同的基因，同时编辑许多细胞，然后实验筛选编辑细胞，进一步运用单细胞测序技术进行分子和表型分析，从而筛选对于生物学作用机制有至关重要的作用的基因和表型【14】；单细胞遗传学方法，即将多种不同gRNA转入细胞后使细胞表达不同的gRNA，然后通过对不同细胞表达gRNA或者其特定标志的条形码进行单细胞测序，从而能够在一次实验中获得所有基因的作用【15】；CRISPR/Cas9能够对大量的细胞添加不同的生物条形码，实现对不同的细胞进行不同的标记，并且这种标记能够遗传给后代子细胞，即诱导DNA瘢痕序列，或通过对Cas9蛋白进行荧光或诱导化学发光技术，结合单细胞测序技术进行追踪细胞谱系。4. 总结与展望
本综述将当前基于单细胞基因组学进行表型分析的发展状况进行了总结，并结合类器官和CRISPR基因编辑技术，对多种技术相互之间如何促进研究发展并结合多项成功案例进行了阐述。作者相信，通过使用单细胞基因组学技术，将来的科学研究能够做到对所有细胞表型进行分类，并能够清楚的指出在组织内处于任何空间任何时间状态的一个细胞的分子特征和这个细胞与其周围环境之间的相互作用关系。而目前短期的研究目标和挑战则是如何将所有检测过程中的细胞分子特征如RNA、DNA、染色质状态或是谱系信息在组织空间结构中找到相对应的位置。除了科学研究的发展，单细胞基因组学面临的另一大挑战是如何更好的应用于临床，比如操作流程的优化、疾病的分类诊断和个体化治疗策略的制定。但总的来说，单细胞基因组学正在高速的发展着，为科学研究和临床治疗有力的支撑。
原文链接：
https://science.sciencemag.org/content/365/6460/1401
制版人：珂
[1] X. Chen, S. A. Teichmann, K. B. Meyer, Ann. Rev. Biomed. Data Sci. 1, 29 (2018).
[2] M. A. Lodato et al., Science 359, 555 (2018).[3] M. M. Chan et al., Nature 570, 77 (2019).[4] J. A. Weinstein, A. Regev, F. Zhang, Cell 178, 229 (2019).[5] D. Calderon et al., Am. J. Hum. Genet. 101, 686 (2017).[6] L. W. Plasschaert et al., Nature 560, 377 (2018).[7] S. Maniatis et al., Science 364, 89 (2019).[8] S. M. Prakadan, A. K. Shalek, D. A. Weitz, Nat. Rev. Genet. 18, 345 (2017).[9] H. Clevers, Cell 165, 1586 (2016).[10] J. G. Camp, D. Wollny, B. Treutlein, Nat. Methods 15, 661 (2018).[11] J. Klaus et al., Nat. Med. 25, 561 (2019).[12] A. M. Pașca et al., Nat. Med. 25, 784 (2019).[13] L. Cong et al., Science339, 819 (2013).[14] S. Konermann et al., Nature 517, 583 (2015).[15] P. Datlinger et al., Nat. Methods 14, 297 (2017).