【学术前沿】睡莲基因组揭示早期开花植物的进化奥秘

专家点评

陈发棣  教授（国家杰青/长江学者，南京农业大学校长）

园艺植物是重要的经济作物，在服务美丽乡村建设、精准扶贫、生态宜居等国家重大战略需求中发挥着十分重要的作用。作者以在分类地位上具有独特地位的睡莲科蓝星睡莲为材料，解析了其基因组，为被子植物起源演化提供了重要的证据。同时在花色、花香等重要观赏性状的分子机制也取得了新认识。

花色作为观赏植物的重要观赏性状，很多观赏植物如菊花、月季、康乃馨、百合等缺乏蓝色花色合成路径，因此蓝色花色一直是花卉育种的重要目标性状之一。作者对蓝色花色的蓝星睡莲与其白色花色的蓝星睡莲自然突变体进行了比较分析，发现在花青素合成路径下游两个基因的差异表达可能是导致蓝色和白色花色差异的主要原因，该发现为蓝色花色形成分子机制研究了提供了重要线索。

花香作为观赏植物的又一重要性状，同时对传粉生物学和物种的繁衍亦具有重要的意义。张亮生课题组与我校陈峰教授课题组合作，明确了睡莲花香的主要成分及其合成基因。发现脂肪酸是其花香成分之一，并鉴定出脂肪酸合成关键酶。该研究指出，睡莲花香的起源相比其他被子植物是相对独立起源的。

该研究在睡莲基因组及花色、花香重要观赏性状分子机制方面取得的新突破，对我国观赏园艺领域物种起源演化及重要性状的基础研究具有重要的推动作用，为其他园艺作物复杂基因组解析提供了借鉴。

杨维才 研究员（中国科学院遗传与发育生物学研究所）

睡莲作为被子植物的主要基部类群，在进化上具有独特的地位。其独特的四核四细胞胚囊发育模式和特殊的水生生殖习性，都是研究生殖发育的好材料。但苦于没有基因组信息，还未得到应有的重视。值得欣喜的是，福建农林大学张亮生团队与美国宾州大学马红团队合作解析了睡莲的基因组，近日发表在Nature杂志上。相信该基因组的发布将极大地促进生殖发育研究，在此表示祝贺！花器官的发育由ABCE四类转录因子相互作用来控制的，即ABCE模型，其中马红教授是C类基因的主要发现者之一【1】。该模型发现至今已有30于年，但对它的研究主要在真双子叶（如拟南芥）和单子叶（如水稻）中，在早期被子植物基部类群中研究不多。张亮生团队及其合作者对睡莲的ABCE基因进行鉴定分析后，发现ABC基因在花器官中表达并不是像拟南芥中那样在各个器官中严格表达，而是广泛的表达。比如睡莲C类基因AG也在花瓣中也有表达。这表明早期被子植物的ABC基因表达可能是广泛表达，在拟南芥和水稻中严格表达可能是后来进化出来的。

此外，睡莲的胚囊与大部分被子植物的不一样，是四核四细胞的Schisandra型，而但双子叶植物大多是八核七细胞的廖型。非常有意思的是，睡莲开花时花苞露出水面，雌蕊先成熟，雄蕊后成熟，经昆虫授粉后花闭合，沉如水中完成种子发育。有了睡莲基因组我们可以对这些独特的生殖发育模式和水生适应机制进行深入的进化发育研究，增进我们了解被子植物的胚囊的起源和分化。

值得一提的是，张亮生教授在博士生期间师从国际知名华人植物学家马红教授。这次在睡莲基因组研究的合作，谱写了一曲师生合奏的新乐章。

王晓武 研究员（中国农科院蔬菜花卉研究所，白菜基因组创新团队首席专家）

论文解读

背景介绍

睡莲是古老的被子植物，具有重要的进化地位和基础研究价值。被子植物又称开花植物，是地球上最繁盛的类群，使我们日常生活中吃、穿、能源、建材等接触最多的植物类群。开花植物在2亿年产生~30万种并占领地球，而其兄弟裸子植物起源至少3亿年前却只有才800种。被子植物快速辐射吸引了许多科学家，并被达尔文认为是“恼人之谜”。睡莲作为早期被子植物类群，其基因组和生物学特点对理解被子植物快速辐射具有重要的意义。睡莲（Water lily）广义上包括了睡莲目三个科接近100个物种，狭义上包括睡莲科睡莲属中5个亚属和~70多个种。 无油樟目（Amborellales），睡莲目（Nymphaeales）与木兰藤目（Austrobaileyales）三个早期被子植物类群，称为ANA被子植物类群【2】。ANA被子植物类群，与单子叶、核心双子叶、以及木兰类等一起组成现在的被子植物，后者被称为核心被子植物 。关于谁是地球上最古老的开花植物类群，目前有三种分支模式，一种将无油樟放在了被子植物最基部分支，第二种中睡莲是最基部分支，第三种无油樟和睡莲目是姐妹类群且同时属于最基部。尽管2013年美国科学家完成了无油樟基因组工作【3】，但是并没有解决其系统位置上的分歧。因此睡莲的基因组不仅能解决谁是现存最早的被子植物类群的问题，也为开花植物进化提供研究资源。

睡莲是最重要的观赏花卉，具有重要的经济和文化价值。 睡莲从东北至云南，西至新疆皆有分布；在植物园、公园、小区的水体里都有种植。睡莲和荷花是全世界非常重要的水生观赏花卉。荷花属于真双子叶，与睡莲亲缘关系距离很远，之前认为它们属于同一类型是误解，只是它们在形态上有很多相似之处。睡莲有50多种原生种，而荷花只有两种，睡莲具有更强的适应性和更为广泛的分布。荷花的花色具有黄、红、白三种主色，睡莲则具有更加丰富的花色，包括了黄、红、白、蓝、紫和各种嵌色系。近20年通过杂交技术培育了大量的睡莲品种，围绕睡莲花开发出了睡莲茶和香水等产品。在文化上，莫奈的睡莲油画非常有名，是印象派画作的代表作；睡莲图案在众多国家国徽、国旗、钱币、邮票上也有出现。

睡莲是园艺植物研究的潜在的模式植物。睡莲目是早期被子植物类群，对于研究被子植物的起源和早起进化具有特殊的意义。由于无油樟是木本植物、每个种子数目少、雌雄异花、生长慢、较高大，没有花色花香，仅分布于南太平洋岛国加里多尼亚。木兰藤目种的物种大都是藤本或者木本，生长周期长。睡莲目中蓝星睡莲，其基因组小，只有400M；蓝星睡莲是热带植物，在海南3-4个月就能完成整个生活史；此外睡莲种子多，一个果实里有几千粒种子。蓝星睡莲的这些特点是十分理想的模式植物【4】。睡莲具有花色花香，而模式植物拟南芥和水稻几乎没有花色花香而无法开展相关研究，通过睡莲可以开展花色花香研究。花色花香是园艺植物非常重要的性状，了解背后的分子机制是分子遗传育种的基础。

测序技术发展迅速，特别是近几年三代测序技术发展突飞猛进。相比传统二代技术大片段文库构建需要昂贵的费用，三代测序技术克服大片段文库构建问题，直接对DNA大片段进行测序且费用不高，使从头组装基因组价格大幅下降，如植物中最早使用三代测序技术完成的复活草（Oropetium thomaeum）基因组【5】。张亮生课题组在此背景下选择了一个只有400M左右的睡莲基因组，使用三代测序技术从头组装和注释，并没有花费很多经费完成高质量睡莲基因组从头拼接和注释工作。

2020年1月2日，Nature正式出版了张亮生组题为The water lily genome and the early evolution of flowering plants（睡莲基因组和早期开花植物的进化）的论文【6】，该论文在12月18号提前在线。张亮生领导的合作团队获得了蓝星睡莲的高质量基因组。由于睡莲独特的进化位置，其基因组与转录组结果展示了早期开花植物的进化特点和特征；同时解析了睡莲的花器官发育和花香花色调控基因，对园艺育种等应用具有重要参考价值。

研究内容

张亮生领导的团队使用第三代测序技术，即单分子测序技术（PacBio RSII）获得了45G数据，使用CANU软件进行组装，获得了睡莲基因组，大小为409 M。其中Contig N50 达到2.1M，45条Contig序列的长度就能覆盖基因组一半。进一步用HIC技术辅助组装，使睡莲基因组的Scaffold N50达27.2M，95.64%的序列锚定到14条染色体上，达到了染色体水平。共注释基因31580个，miRNA数目124个。

通过系统发育树组分析显示睡莲和无油樟属于早期被子植物类群，支持无油樟是最早的被子植物类群。由于有了睡莲基因组，加上无油樟，以及单子叶和真双子叶进行祖先关系重构。选择了大量单拷贝基因进行分析，发现50~60%左右的单拷贝基因支持无油樟在最外面，10%左右基因支持睡莲在被子植物最外面，还有30%左右基因支持睡莲和无油樟是姐妹类群位于被子植物最外面。因此总的结果支持无油樟在被子植物最外面。我们还通过更多的被子植物基因组和转录组序列来构建被子植物的进化关系，选择了44个测序的基因组，71个被子植物的转录组数据，包括被子植物主要类群。获得了主要被子植物类群的进化关系，如下图d。发现还是支持无油樟属于被子植物最外面类群，其次是睡莲目。同时结果支持木兰类靠近核心双子叶；石竹目靠近蔷薇类群；葡萄靠近蔷薇类群。

利用115个物种数据，我们选择了101个单拷贝基因来估计被子植物各个类群的分化时间，获得了被子植物各个类群的分化时间。据我们所知，115个物种的101个单拷贝基因计算被子植物各个类群分化时间，之前没有用这么大数据量（矩阵）来计算过。根据21颗化石的标定计算，所有被子植物的起源时间可以推算到234至263百万年前。而单双子叶则分化于171到203百万年前。在睡莲目中，睡莲科与莼菜科在147至185百万年前分化。

通过基因组分析可以明显看到睡莲基因组很多基因有共线性关系，显示睡莲发生过基因组加倍（多倍化）。根据Ks估计，这次基因组加倍事件的Ks峰在1左右，属于古老的基因组加倍(多倍化)事件。通过与睡莲科其它物种转录组数据比较，这次基因组加倍事件至少发生在睡莲科之前。利用莼菜转录组数据进行比较分析，发现其有可能是发生在莼菜科之前，是整个睡莲目祖先的基因组加倍事件。

花的发育主要由MADS-box转录因子控制，其中花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊主要由MADS-box转录因子中的AP1、AP3/PI、AG和SEP基因控制，这个模型简称ABCE模型。我们对睡莲的根茎叶，以及花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊进行转录组分析，获得MADS-box转录因子在这些组织的表达值。发现在花萼和花瓣中主要表达是AGL6，在雄蕊中也有表达，见下图a。AP3在花萼，花瓣，雄蕊和雌蕊都有表达，但是在花瓣中较高，其次分别是雄蕊，花萼和雌蕊。PI基因也是在花瓣中表达较高。AGa主要在雌蕊和雄蕊中表达，而AGb在四个器官中都有表达。SEP1也是在四个器官中都有表达。因此根据表达我们可以推测，睡莲的A基因应该是AGL6；B基因主要是AP3其主要作用，PI也属于B基因；C基因主要是AGa和AGb；E基因是SEP1。其中AGb基因除了雌蕊和雄蕊中表达，还在花瓣和萼片中表达，表达模式类似SEP1基因，其可能发生功能分化，主要是亚功能化，也有可能产生了新功能。ABCE基因在单子叶和核心双子叶中具有严格的表达模式，比如C基因只是在雌蕊和雄蕊表达，B基因只在萼片和花瓣中表达，而睡莲ABC基因具有广泛的表达情况，与核心双子叶并不一样，表明早期被子植物的ABC基因可能具有广泛的表达，只是在单子叶和核心双子叶中严格表达，是后期进化出来的。睡莲的ABC基因表达情况可能也解释了萼片和花瓣没有真正意义上的分化，与被子植物花的祖先相似。

根据液相气谱分析，睡莲的花香气味中包含有十一种不同的芳香成分，主要是萜类和脂肪酸。睡莲丢失编码萜类合成酶中Tps-a亚家族。睡莲花香中倍半萜不是由核心双子叶和单子叶中的Tps-a亚家族编码蛋白来催化，而可能是由Tps-b/g来催化的。在单双子叶植物的花气味中，不包含脂肪酸成分，而在睡莲中能够被检测到，表明睡莲独立进化出了花香中的脂肪酸成分。作为脂肪酸合成重要基因的SABATH甲基转移酶家族，睡莲共有13个该家族的成员，其中12个是睡莲所特有的。其中一个基因在花瓣中高表达，我们在酵母中合成了这个蛋白，发现其具有催化的活性，推测这个基因是编码合成脂肪酸的蛋白。脂肪酸又是睡莲花香中独立起源，因此我们推测睡莲的花香成分起源与其它被子植物是不一样的，和单双子叶是平行进化的。

在整个开花植物的花色谱系中，蓝色系花卉稀有，蓝色花瓣很漂亮，因此世界上大量的园艺育种工作者都将蓝色花卉的新品种选育作为花卉育种目标和研究重点。我们测序的物种蓝星睡莲有蓝色花瓣，如上图，是研究和鉴定蓝色花瓣中关键基因好材料。通过液相气谱分析，发现花青素合成通路末端生成的没食子酰和乙酰修饰的半乳糖苷飞燕草素是蓝色花瓣的的重要成分。通过与已知的花青素合成途径基因进行比较分析，推测出了睡莲的花青素合成途径基因。我们还获得蓝星睡莲自然条件变异种，白色蓝星睡莲，其花瓣是白色的。我们对白色蓝星的白色花瓣和蓝色花瓣进行比较分析，发现参与花青素合成途径中有两个基因在蓝色花瓣中特异高表达，而在白色花瓣表达很低或不表达。这两个基因刚好位于花青素合成途径最后两个环节，推测这两个基因编码蛋白可能是催化生成蓝色花青素重要酶。

睡莲在寒带都有分布，如中国西部和加拿大西部，但是无油樟只在太平洋岛屿有分布，木兰藤目只在热带和温带有分布，因此睡莲比其它早期被子植物类群的物种分布要广泛。这种广泛分布显示睡莲具有较强的适应性，因此我们对睡莲的相关基因家族进行了鉴定和比较，发现编码抗病蛋白，激酶和WRKY转录因子的基因与无油樟以及其它核心被子植物比较有明显的扩张。这些基因的扩张可能与睡莲具有广泛的适应性相关联。

讨论

该研究结果显示睡莲经历了比较古老的基因组加倍。在睡莲和核心被子植物的祖先的ABC基因在不同花器官种表达可能比较广泛。睡莲的基因组加倍，以及核心被子植物中经常发生的基因组加倍是MADS-box 基因以及花色花香合成基因数目增加的因素。睡莲和核心被子植物的基因组加倍和新颖的进化模式在花器官的发育以及颜色合成和气味化合物的中起着一定的作用。花的这些特征和特性调控基因在早期被子植物中就存在，但是进一步分化和多样性还需要谱系特异性基因组加倍来促进。相比之下，无油樟与睡莲分化之后，未经历基因组加倍，没有花香和颜色变化，而睡莲经历过基因组加倍，使其具有丰富的花色花香而更像核心被子植物。因此，睡莲和核心被子植物的基因组加倍或其它进化驱动因素促进了包括与授粉媒介的相互作用，通过为这些动物提供花粉而提高自身的多样性。

睡莲的花香花色研究不只是对理解早期开花植物具有重要意义，同时对园艺植物的花色花香研究具有重要参参考价值。该研究测序的蓝星睡莲具有蓝色花瓣，而蓝色花瓣在一般观赏花卉并不具有这个颜色，是很多育种学家想培育的颜色，如蓝色玫瑰和菊花。除了花色，睡莲具有浓郁的花香，花香具有重要的工业价值。我们对睡莲的花色花香途径进行了解析，这对后续的应用研究具有重要的参考价值。

据悉，福建农林大学张亮生教授是该论文的第一作者和唯一通讯作者，福建农林大学是第一作者单位和通讯单位。其中共同第一作者有南京农业大学陈飞，福建农林大学张兴坦，比利时根特大学Zhen Li，复旦大学赵义勇等。张亮生教授，南京农业大学陈飞博士和陈峰教授，根特大学Yves Van de Peer教授，美国宾州州立大学马红教授，福建农林大学唐海宝教授是共同指导作者(These authors jointly supervised this work)。

参考文献

1. Yanofsky, M. F. et al. The protein encoded by the Arabidopsis homeotic gene agamous resembles transcription factors. Nature 346, 35-39, doi:10.1038/346035a0 (1990).

2. Qiu, Y. L. et al. The earliest angiosperms: evidence from mitochondrial, plastid and nuclear genomes. Nature 402, 404-407 (1999).

3. Albert, V. A. et al. The Amborella genome and the evolution of flowering plants. Science 342, 1241089 (2013).

4. Chen, F. et al. Water lilies as emerging models for Darwin's abominable mystery. Hortic Res 4, 17051, doi:10.1038/hortres.2017.51 (2017).

5. VanBuren, R. et al. Single-molecule sequencing of the desiccation-tolerant grass Oropetium thomaeum. Nature 527, 508-511, doi:10.1038/nature15714 (2015).

6. Zhang, L. et al. The water lily genome and the early evolution of flowering plants. Nature 577, 79-84, doi:10.1038/s41586-019-1852-5 (2020).

https://doi.org/10.1038/s41586-019-1852-5

来源：BioArt植物