出乎意料！HPV阳性的口咽癌患者预后更好？临床医生与方法学专家共同深度解析

首先向大家介绍一下口咽癌发病的基本情况。

口咽癌是常见的致死性疾病，在世界范围内，每年约有93000人发病，并有51000人死亡。口咽癌的发病率在多个国家（多数为发达国家）呈上升趋势。在英国，大约每年有3000人被诊断为口咽癌。

世界卫生组织公布的最新数据显示，2020年世界范围内口咽癌发病率最高的地区是中东欧，死亡率最高的地区是西欧；包括中国在内的东亚地区发病率和死亡率均处于较低水平。

WHO数据显示，2020年中国有5604人被诊断为口咽癌，占所有肿瘤的0.12%；因口咽癌死亡的人数为2905人，占所有肿瘤死亡人数的0.1%。

饮酒和吸烟是口咽癌公认的危险因素，然而，最近科学家发现HPV感染也是口咽癌的重要发病诱因，并且显著影响患者的生存情况。

今天我们关注的话题是HPV和口咽癌的关系，那接下来我们聊一聊HPV。

HPV是什么，主要通过哪些方式传播呢？

HPV（Human papillomavirus）中文全称为“人乳头瘤病毒”，1949年被首次发现，属于乳多空病毒科，为无包膜病毒，直径约55nm。HPV为双链环状DNA病毒，基因组长度约7900bp，所有蛋白转录相关开放阅读区局限在其中一条链。

基因组根据功能可分为三部分：a）早期序列（E1、E2、E4、E5、E6、E7，部分有E3、E8），这些与病毒复制及致癌作用相关；b）晚期序列（L1、L2），主要翻译L1及L2病毒衣壳蛋白；c）上游非编码序列即长调控序列（LCR）。

所有HPV携带者均可作为传染源传播病毒，最主要的传播途径是性接触传播。其他传播方式，如与他人共用浴盆、毛巾、马桶坐便器等理论上也可造成间接传播。此外，妊娠分娩过程中，婴儿也可能在经过母亲产道时被传染。

听说HPV感染和女性生殖系统肿瘤高度相关，但没想到和口咽肿瘤也有关系。这是为什么呢？

HPV可通过口腔-生殖器官的直接接触（口交）在口腔和生殖器官之间传播。HPV感染在肛门、生殖器周围非常普遍，近半个世纪以来，随着人们性观念的改变，口交已成为一种常见的性交方式，并且在口交时往往不会使用安全措施进行防护，增加了HPV的传播概率。研究显示，性生活比较活跃、性伴侣较多的人感染HPV的概率较高（女性84.6%，男性91.3%）。

HPV感染既然和口咽癌有关，而男性又是易感人群，男士是不是也应该接种HPV疫苗呢？

的确如此。

男性接种HPV疫苗主要有两层意义：

首先，可以保护自己不受HPV感染而引发相关疾病，包括口咽癌、口腔癌、肛门癌、阴茎癌等恶性肿瘤以及生殖器疣。其次，因为HPV主要通过性行为传播，感染了HPV的男性，还可能通过性生活将HPV传染给性伴侣，增加性伴侣的健康风险。

男性接种HPV疫苗可以降低自身携带病毒的概率，预防双方HPV交叉感染，也间接减少了女性罹患宫颈癌的风险。

HPV疫苗能预防所有的HPV感染吗？

并不能。

截至2003年，已经发现的HPV超过200种，其中可感染人的HPV约30多种。根据HPV与宫颈癌的关系，又可以分为低危型和高危型。目前我们的疫苗主要包括二价疫苗（预防高危16/18型HPV），四价疫苗（预防高危16/18型和低危6/11型HPV）以及九价疫苗（预防高危16/18/31/33/45/52/58型和低危6/11型HPV）。可见疫苗并没有覆盖所有病毒类型。

补充一点，虽然HPV疫苗并没有覆盖所有的HPV型别，但对于易感人群来说，疫苗可以预防几种高危亚型，仍然可以起到很好的疾病预防效果，“防患于未然”。

介绍完HPV的相关知识点，从临床医生的角度我们也很想知道，如果想研究HPV感染和口咽癌预后之间的关系，应该怎样设计和分析呢？

关于HPV和口咽癌预后相关的研究不少，今年就有一篇论文发表在Cancer 杂志上。今天我们就以此篇论文为例，一起看看在探究HPV与头颈肿瘤预后关系以及类似的临床研究中，我们在研究设计、资料收集和统计分析环节都有哪些需要注意的问题。

首先，关于研究对象的筛选。在这篇论文中，为了研究HPV感染与口咽癌预后的关系，研究人员从名为“头颈5000”的一项前瞻性队列研究中选取了1411例口咽癌患者作为研究对象，病理类型全部为鳞状细胞癌。

先来看看什么是“头颈5000”。

根据肿瘤的起源位置，进一步将患者分为4个亚组：扁桃体型、舌根型、其他型、未知型。

对于一些较大的癌肿来说，由于其可跨越几个解剖学部位，不太容易明确其起源位置而难以将其确切归类。研究对象的入组过程可以用以下流程图清楚地展示。

研究对象筛选之后应该就是资料的收集过程了。在这项研究中，HPV是我们感兴趣的暴露因素，对于HPV感染信息的收集，应该是非常关键的过程。

没错。

文章也对HPV筛查作了详细的描述。该研究中所有受试者在基线时都要抽血做HPV感染筛查，所筛查的HPV型别包括HPV16、18、31、33、 35、45、52、58。HPV抗体主要检测了L1、E6和E7，HPV16、18型别还另外检测了E1和E2。根据筛查结果，患者被分为两类：HPV阳性（HPV-driven）和HPV阴性（HPV-negative）。

除HPV感染信息外，在资料收集过程中，我们还应注意收集其他影响结局指标（在这项研究中为是否存活）的重要信息，例如肿瘤分期、治疗方案、是否存在合并症等。研究者收集了患者的肿瘤-淋巴结-转移（TNM）信息，并依据第7版的TNM分期指南进行了分类。对于HPV阳性的患者，还应用了国际口咽癌分期协作网络（International Collaboration on Oropharyngeal Cancer Network for Staging）提出的替代分期方法。

对于治疗方案信息的收集，研究者按照受试者实际接受治疗的情况，把他们分为7组：

①仅做原发灶切除手术；

②原发灶切除手术和颈部手术；

③仅做放化疗；

④仅做放疗；

⑤手术联合放化疗；

⑥手术联合放疗;

⑦其他。

此外，根据是否有合并症将患者分为4组：无合并症、轻度呼吸困难、中度呼吸困难和严重呼吸困难。

除基本的临床信息外，还需要了解患者的人口社会学信息，以及健康生活方式信息等。这些健康相关信息在了解疾病致病及预后影响因素中也十分重要。因此，研究者通过问卷和历史资料回顾等方式收集了患者年龄、性别、吸烟史等信息。

以上说的均是暴露因素或者重要的可能存在混杂的因素的收集，对于临床研究来说，明确结局指标并准确地采集结局信息是十分重要的。

在这个研究中，结局指标比较单一，就是生存状态（存活vs.死亡）。研究者通过关联受试者在英国国家医疗服务体系（National Health Service，NHS）数据库中的信息，来进行受试者在随访期内死亡及死因数据的收集。随访截止日期为2020年2月1日。

是的，这个研究中只有一个结局指标。有些预后研究可能有不只一个结局观察指标，这时一般会区分主要结局指标和次要结局指标。例如，不仅可以观察受试者是否生存，还可以对生存质量、卫生经济学相关的指标进行评价，这时可以设计一些次要结局指标。这些指标的设立当然要结合想要回答的科学问题，以及目前研究中资料的可获得性。如果是基于历史资料的回顾性研究，可能某些研究结局指标是无法获取的。

资料收集完成之后，要怎样对数据进行分析呢？

统计学分析的基本思路是由浅入深，层层递进的。以这个研究为例，预后分析一般都涉及到生存资料，核心是生存分析，这里也涉及到不同的统计学方法。

首先是基本描述。研究者应用Pearson卡方检验（适用于分类资料）对两组受试者的基本特征进行了比较，看看两组人群在基线时是否存在差别。两组人群之间在某些指标上存在差异，可以为后续的统计建模校正混杂因素等环节提供一些线索。

其次，是本研究中核心的生存分析部分。研究者应用了Cox比例风险回归模型用来评估HPV感染与口咽癌死亡之间的关系。通过Cox回归计算风险比（Hazard ratio, HR）值及其95%置信区间。

在Cox回归中研究者采用了两个模型，一个是部分校正模型（partially adjusted model），另一个是完全校正模型（fully adjusted model）。部分校正模型里校正的因素包括年龄、性别，而完全校正模型里的校正因素包括年龄、性别、吸烟（目前吸烟或不吸烟）、合并症（无，轻度，中度，重度）。

为什么要校正呢？不校正会怎么样？

校正主要是为了控制或消除混杂因素（confounding factor）或其他因素对暴露-结局真实效应的影响，不校正的话很可能得到虚假（效应值的夸大、削弱甚至方向相反）的关联结果。其中消除混杂因素的影响是应用模型校正的重要原因和主要目的。混杂是指由于某个第三变量的作用，致使研究因素与结果的联系被歪曲，这个第三变量就叫混杂变量或者混杂因素。混杂因素的判断标准通常可以这样理解：与暴露因素和结局指标/事件均相关，但又不是存在于二者之间的中间环节。用单向无环图可以清晰地表示：

在这项研究中，吸烟既与HPV感染有关（吸烟状况在HPV阳性和阴性组中的分布不同），又与口咽癌患者的预后相关（根据既往报道，吸烟者的生存情况较不吸烟者差），且不是HPV感染和口咽癌预后的中间环节（即HPV感染和口咽癌预后的关系不需要通过吸烟起作用）。

因此，吸烟在这项研究中是一个混杂因素。研究者将吸烟这一变量纳入多因素模型以消除其可能的混杂作用。除了模型校正之外，常用的控制或消除混杂的方法还有分层分析。例如，研究者对HPV感染与口咽癌预后的关系在不同年龄组、性别、吸烟状态、肿瘤位置的患者中分别进行了探索。需要注意的是，分层分析往往意味着样本量的损失（例如每个年龄组的人数可能较少，不满足构建模型的最小样本量需求），对于一些小样本的研究，分层分析可能并不适合。

好的，大致的统计分析思路搞清楚了，下面我们来看看研究的主要发现。

首先是基本特征的描述。1411例患者中，超过70%HPV阳性（1001例，70.9%）。HPV阳性患者主要为年轻男性。吸烟状况在两组之间存在较大差异，HPV阳性组仅8%的患者目前吸烟，而HPV阴性组则有接近50%的患者吸烟。与HPV阴性患者相比，HPV阳性患者的肿瘤分期更晚（3期或4期）。HPV阳性患者更多地接受了放化疗，且合并症的发生率也更低。HPV阴性患者肿瘤较少发生在扁桃体部位，大部分在其他位置。

第二部分，也是结果中最核心的部分，是展示HPV与口咽癌预后的关系。受试者的中位随访时间为5.9年（最短13d，最长8.9年），437例患者在随访期内死亡。总体来看，HPV阳性的口咽癌患者生存情况更好（表2），HPV阳性患者的死亡风险是HPV阴性患者的43%（95%置信区间：33%-56%）

Whitmarsh A et al. Cancer, 2021

正如前面提到的，研究人员在不同特征的患者中还进行了分层分析，探讨HPV感染状况和其他因素的相互影响。例如，在表2所展示的结果中还有不同年龄组、性别、吸烟状况与疾病预后的关系。HPV阳性患者的预后情况整体优于HPV阴性患者，而这种健康效应在65岁以下人群中似乎更明显；女性HPV阳性患者的生存获益略高于男性HPV阳性患者（HPV感染的保护效果更强）。

刚才提到吸烟可能是个混杂因素，在表2里通过对吸烟状况进行分层分析，避免了由于吸烟状况在HPV感染不同组别中分布不同而造成的HPV感染和口咽癌预后关联效应值的有偏估计。从结果中可以发现，无论是否吸烟，HPV阳性组的死亡风险均低于HPV阴性组。

此外，除了将HPV感染状态一分为二，进行“有或无”的分类外，还可以考虑HPV抗体的浓度值，探讨HPV抗体浓度和预后的剂量-反应关系。如在表3中，研究者就以E16抗体浓度值作为自变量，把HPV阴性作为参照组，探索E16抗体不同浓度和患者预后的关系。虽然结果显示抗体浓度值和预后情况不存在剂量-反应关系，但这种分析思路值得小伙伴们借鉴。

Whitmarsh A et al. Cancer, 2021

在这项研究中，HPV16型感染被定义为HPV阳性，然而，有些患者的HPV16抗体阳性状态可能是由于和其他HPV型别的交叉反应引起的。于是，研究者把合并其他型别HPV感染的受试者挑选出来，将他们从分析数据集删除之后重复了上述分析（敏感性分析）。除了以上结果外，文章中还用生存曲线描绘了不同组别患者的生存情况，感兴趣的读者可以阅读原文。

文章解读完了，读者可能还有不少疑问，例如，我最大的困惑就是，为什么感染HPV的口咽癌患者反而预后更好呢？

关于HPV相关口咽癌预后较好的原因，目前尚无统一意见。部分学者将HPV阳性肿瘤预后较好归因于对放化疗的敏感性增强。E6介导的p53降解作用可能与HPV阴性头颈肿瘤中p53基因突变不同，未突变的残存的p53可以增加对DNA损伤因子的敏感性，使得HPV阳性头颈肿瘤中存在完整的放化疗凋亡反应。

其他的研究结果表明，在HPV16阳性口咽癌中存在RBBP4过表达及RBBP4依赖的Akt去磷酸化，可能抑制放疗抵抗通路。同时，以顺铂为基础的化疗可能抑制HPV E6癌蛋白的功能从而恢复p53活性。然而，单纯手术的HPV阳性肿瘤患者较分期相当的HPV阴性患者的预后仍有所改善。

最新的临床试验发现，HPV阳性和HPV阴性的头颈部鳞癌患者对免疫治疗的反应存在差异，提示HPV阳性头颈部鳞癌可能存在独特的肿瘤免疫微环境。HPV相关头颈肿瘤基因突变较HPV阴性头颈肿瘤明显减少，主要与病毒相关癌蛋白E6和E7等的作用相关，可能可作为外来抗原刺激机体产生较强的免疫反应，引起感染细胞的清除。

虽然感染HPV和罹患口咽癌都是不幸的事，但正如人们常说的，“上天是公平的，当为你关上一扇门的同时，总是会为你打开一扇窗”，HPV阳性者的预后反而更好。当然，无论是否感染HPV，积极配合医生治疗，保持乐观向上的心态，都将有助于健康和提升生活质量。

在此也祝愿大家身体健康，生活幸福！本期提到了临床研究中常见的疾病预后研究，实际上预后研究中的方法学内容还是十分丰富和比较复杂的。今后有机会期待和大家进行更多交流。