SBB：无机肥对土壤中固氮菌丰度和群落结构的影响
25年的无机施肥处理对华南酸性土壤中固氮菌丰度和群落结构的影响
Impact of 25 years of inorganic fertilization on diazotrophic abundance and community structure in an acidic soil in southern China
Soil Biology & Biotechistry [IF：5.795]
http://dx.doi.org/10.1016/j.soilbio.2017.06.019
发表日期：2017-06-22
第一作者：Chao Wanga
通讯作者：Renfang Shen(沈仁芳)(rfshen@issas.ac.cn)a,c
合作作者：Manman Zheng, Wenfeng Song, Shilin Wen, Boren Wang, Chunquan Zhu
主要单位：
a中国科学院土壤研究所土壤与可持续农业国家重点实验室(State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China)
c中国科学院大学( University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)
写在前面
分享标题：SBB：无机肥对土壤中固氮菌丰度和群落结构的影响
关键字：作物栽培，固氮生物，长期无机肥料，养分有效性，nifH，生石灰应用
点评：固氮微生物负责的生物固氮是一个重要的生物地球化学氮素循环过程。由于该生物过程可以为生态系统提供额外的氮源，从而改善土壤肥力，这有利于提高植物的生产力，因此它是农业系统中无机氮肥的潜在可持续替代品。然而，尽管已经进行了一些短期的小区试验（在一个完整的生长季节内），但是，短期试验不能提供一些只有在长期施肥条件下才能检测到的有价值信息，因为土壤质量变化缓慢，微生物群落结构需要一定的时间才能稳定。因此对于农业生态系统中固氮菌对长期施肥的响应还没有很好的了解。这里，作者研究了经历25年的无机施肥的酸性农田土壤中生长着玉米的土体土和根际土壤中的固氮微生物群落。详细了解固氮菌的群落组成和丰度，以及它们与土壤环境的关系，将有助于我们更好地理解施肥的长期生态效应和固氮菌在农业生态系统中的生物功能，并减少无机氮肥的使用。
摘要
尽管固氮微生物在氮素循环中起着重要的作用，并为植物可利用氮的积累做出贡献，但长期无机施肥对其种群的影响我们尚不清楚。这里，我们研究了经历25年的无机施肥的酸性农田土壤中生长着玉米的土体土和根际土壤中的固氮微生物群落。施肥管理包括不施肥对照，仅施氮肥，氮肥与生石灰共施，磷(P)和钾(K)肥共施，N+P+K肥共施，N+P+K肥与生石灰共施。定量PCR和高通量焦磷酸测序的nifH基因用于分析固氮微生物的丰度和群落组成。所有施肥处理均提高了土壤养分有效性，但未施用生石灰的处理引起土壤酸化。N肥与N+P+K肥处理的玉米生物量和nifH基因拷贝数显著降低但在P+K处理 中增加。生石灰的应用有效地减轻了N输入的固氮抑制作用。施肥导致土壤微生物丰富度降低及固氮微生物群落组成发生变化。土壤pH和养分有效性对固氮丰度有协同作用，尽管土壤养分有效性似乎是塑造固氮群落结构的主要因素。在目前的研究规模上，根际效应增加了nifH基因的拷贝数，但并未明显改变固氮群落的组成。总之，长期无机施肥对固氮菌群丰度和群落组成均有影响，且施肥处理对群落组成的影响大于生石灰修复或作物栽培。
背景
为了满足日益增长的世界人口对粮食的需求，由此产生了集约化农业措施，其包括施用过量的无机肥料。在中国，以氮(N)，磷(P)和钾(K)为基础的肥料消费量从1961年的73万吨增加到2013年的3894万吨，预计在未来几十年内将继续增加。在过去的几十年，农业生态系统中无机肥料(尤其是氮基肥料)的长期投入提高了土壤肥力和作物产量，但也产生了各种负面影响，例如土壤酸化，金属毒性，较低的养分利用率，温室气体排放的增加和地下水污染，这些威胁到了土壤质量，作物生长，生物多样性和环境健康，并改变了土壤营养元素(例如碳(C)，氮和磷)的生物地球化学循环。因此，如何安全地提高农业的可持续性受到越来越多的关注。
N循环是影响陆地生态系统生产力和可持续性的重要营养循环。微生物是土壤氮素循环的重要参与者，在调控土壤氮素有效性和转化方面起着重要作用，且与植物生产力密切相关。大量施肥对土壤氮循环产生了前所未有的影响，其涉及到多种多样的微生物群落和功能的变化。迄今为止，大多数研究都集中在长期施肥对氨氧化和反硝化微生物的影响上，因为它们与土壤酸化、植物氮有效性和氮损失直接相关。固氮细菌(固氮微生物)负责生物固氮，这是另一个重要的生物地球化学氮循环。由于该生物过程可以为生态系统提供额外的氮源，从而改善土壤肥力，这有利于植物的生产力，因此它是农业系统中无机氮肥的潜在可持续替代品。然而，尽管已经进行了一些短期的微区试验（在一个完整的生长季节内），但对于农业生态系统中固氮菌对长期施肥的反应方式还没有很好的了解。因为，短期试验不能提供一些只有在长期施肥条件下才能检测到的有价值的信息，因为土壤质量变化缓慢，微生物群落结构需要一定的时间才能稳定。详细了解固氮菌的群落组成和丰度，以及它们与土壤环境的关系，将有助于我们更好地理解施肥的长期生态效应和固氮菌在农业生态系统中的生物功能，并减少无机氮肥的使用，详细了解固氮菌的群落组成和丰度，以及它们与土壤环境的关系，将有助于我们更好地理解施肥的长期生态效应和固氮菌在农业生态系统中的生态功能，从而减少无机氮肥的使用。
施肥方式通过改变土壤特性直接或通过改变植物反馈间接影响土壤微生物群落结构和丰度。在长期施肥过程中，土壤理化性质的变化，如pH值、养分有效性、碳的数量和质量等，对土壤微生物种群产生了积极或消极的影响。固氮菌对土壤性质也很敏感。此外，植物作为另一个重要的驱动因子，与根际微生物群落的功能和活性有着密切的关系。玉米、水稻、大豆、高粱等作物的生长形成了根际独特的固氮群落，其不同于土体土壤中的群落。并且根际微生物通过积极的或消极的性状直接影响植物的生长。因此，根际中植物微生物相互作用的变化在农业生产中具有重要意义。以往关于长期施肥对土壤微生物群落影响的研究主要局限于土体土壤尺度。这导致我们缺乏对与植物相关的根际微生物群落对施肥反应的深入了解。
无机氮输入引起的土壤酸化已成为我国南方红壤地区作物产量的主要限制因素。在农业管理中，石灰是治理酸性土壤、保持作物产量和改变微生物种群的有效手段。Xun等人报道，石灰的添加可以迅速增加酸性农田土壤的pH值和细菌多样性。同样，我们之前的研究发现，石灰施用于酸性土壤显著提高了整体细菌和氨氧化菌的丰度，但是，此类信息不适用于固氮细菌。
在这项研究中，样本是从1990年建立的中国南方一个长期受肥区采集的。2010年采用了一些严重的酸化方法，并通过添加生石灰对部分地区进行了补救。该地区以往的研究主要集中在长期施肥对作物生产、土壤酸化、土壤酸化修复方法、土壤酶活性、总体细菌丰度和氨氧化细菌丰度的影响上。然而，对固氮细菌的影响仍然是未知的。因此，我们选择施肥25年的试验点，研究不同施肥处理下土壤固氮种群的变化。目标是:(1)确定固氮菌丰度和群落组成对长期无机施肥的响应及其与土壤性质的关系；(2)评价长期无机施肥对根际效应的影响；(3)检验石灰修复是否也能改善酸性土壤中的固氮菌群。为此，我们选择了固氮酶还原酶亚基基因nifH，因为它是分析固氮细菌丰度和多样性最常用的标记基因。定量pcr和高通量测序分别用于测定nifH基因的丰度和群落结构。
结果
玉米生物量与土壤性质
Maize biomass and soil propertiess
与未施肥的对照相比，长期施氮显著降低了玉米生物量(p<0.05)，而PK处理则使生物量增加(图. 1)。NPK和CK产生了同等的玉米生物量。生石灰(NCa和NPKCa)的施用显著增加了玉米生物量，NPKCa处理的玉米生物量大于NCa处理(p<0.05)。
图 1 25年(1990 - 2015)的长期施肥试验的玉米生物量
Maize biomass from the 25-year (1990e2015) long-term fertilizer experiment
数据为平均数±标准差(n=15)。条柱上的不同字母表示肥料处理之间的差异显着，p <0.05。
土壤性质见表1。双因素方差分析显示，除pH、TC和TN外，施肥处理对土壤各性状参数均有显著影响(p<0.01)，根系效应(土体与根际土壤)对各性状参数也有显著影响(*p*<0.01或*p*<0.05)。与块状土壤相比，根际土壤中SOC，DOC和DON的含量较高，而NH4+-N，NO3--N，AK和AP的含量较低。在土体土中，CK(5.38)、NCa(5.20)和NPKCa(5.12)的pH值差异不显著，均高于N(4.04)、PK(4.95)和NPK (4.00) (p<0.05)，其中N和NPK处理的pH值最低(**表 1**)。PK、NPK、NPKCa处理下TC、SOC、DOC含量均高于CK、N、NCa处理。含氮肥（N，NCa，NPK和NPKCa）处理下的NH4+-N，NO3--N和TN含量均高于不含氮肥（CK和PK）的处理，但NPKCa处理下的NH4+-N和NO3--N除外。同样，在同时施用P肥和K肥的处理下，AK和AP的含量均增加。N处理的C/N比例最低，但与NCa处理无显著差异。在CK、N、PK和NPK处理下，DON没有显示出统计学差异。
表 1 25年(1990 - 2015)长期施肥试验玉米栽培的土体和根际土壤理化性质
Soil physicochemical properties in the bulk and rhizosphere soils of maize cultured for the 25-year (1990e2015) long-term fertilizer experiment
数据为均值±标准差(n=3)。每行不同字母表示对于根际和土体土壤不同的施肥处理之间的差异显著(p<0.05)。每个处理中粗体星号表示土体和根际土壤存在显著差异(*p*<0.05)。TC：总碳；TN：总氮；C/N比：总碳/总氮；SOC：土壤有机碳；DOC：可溶性有机碳；NH4+-N：铵态氮；NO3--N：硝态氮；DON：可溶性有机氮；AK：有效钾；AP：有效磷。
nifH基因拷贝数及其与土壤性状的关系
nifH gene copy number and its correlation with soil properties
双因素方差分析显示，施肥处理和根系效应对nifH基因拷贝数均有显著影响(p<0.01)(**图. 2**)。此外，学生t检验表明，各处理根际土壤的nifH基因拷贝数均明显高于土体土壤(*p*< 0.01或*p*< 0.05)。在土体土壤中，每克干燥土壤中六种处理的平均拷贝数范围为0.58*105至3.85105个基因拷贝(图. 2)。与对照相比，PK组的nifH基因拷贝数较高，而N和NPK的nifH基因拷贝数显著降低(p<0.05)。在NCa和NPKCa处理中施用生石灰显著减轻了N基肥料的这种抑制作用，甚至NPKCa中的nifH基因拷贝数也显着高于CK(p<0.05)。在根际样品中也得到了相似的结果，但CK和NCa处理之间没有显著差异(图. 2)。皮尔逊相关分析表明，在土体土壤中，nifH基因拷贝数与土壤pH，C/N和AP正相关，与NH4+-N和NO3--N负相关。根际土壤中nifH基因拷贝数与pH，C/N和AK呈正相关，与NH4+-N和NO3--N呈负相(表 2)。在所有土壤样品中，包括土体土壤和根际土壤，nifH*基因拷贝数与pH，C/N，SOC，DOC和DON呈正相关，与NH4+-N和NO3--N呈负相关。
图 2 通过real-time PCR定量分析了25年(1990 - 2015)长期施肥试验玉米栽培的土体和根际土壤中nifH基因拷贝数
nifH gene copy number as quantified by real-time PCR in the bulk and rhizosphere soils of maize cultured during the 25-year (1990e2015) long-term fertilizer experiment
所有数据均采用双因素方差分析，T:施肥处理;R:根系效应(土体和根际)。白柱上方不同的小写字母表明，在p<0.05的水平上，土体土的施肥处理间存在显著差异；灰柱上方不同的大写字母表明，在p<0.05的水平上，根际土的施肥处理间存在显著差异。各施肥处理的星号(*p<0.01和p<0.05)表明土体土壤和根际土壤之间存在显著差异。
表 2 nifH基因拷贝数与各土壤变量间的Pearson相关系数
Pearson’s correlation coefficients between total nifH gene copy number and various soil variables
群落结构分析
Community structure analyses
经过氨基酸序列的质量过滤筛选，得到107,039个高质量序列，每个样本有870至5258个序列，OTUs的数量(90%相似度)根据样本的不同，在42至109之间。为了比较群落组成的相似性和差异性，我们基于OTU组成进行了NMDS、层次聚类分析和ANOSIM分析。NMDS的stress值为0.09(图. 3a)。本分析分为三组:CK和PK的土体和根际样品;N和NCa的土体和根际样品;以及NPK和NPKCa的所有样品。层次聚类分析得到了类似的结果(图3b)，群落形成了三个聚类，所有的NPK和NPKCa样品，只含氮肥的处理(N和NCa)，以及CK和PK样品。用ANOSIM分析了群落组成的差异，其中无氮处理(CK和PK)和含氮处理(N、NCa、NPK和NPKCa)之间存在显著差异(p<0.01)，而土体和根际样品之间没有差异。因此，施肥处理对群落组成和结构的影响远远大于根系效应和生石灰施用对群落的影响。由于不同施肥处理对根际土壤的影响较小，因此本研究的重点是土体土壤样品。
图 3 25年(1990 - 2015)长期施肥试验中玉米根际和土体土壤中固氮群落组成的非度量多维尺度分析(A)和层次聚类分析(B)
Non-metric multi-dimensional scaling analysis (A) and hierarchical cluster analysis (B) of diazotrophic community composition in sampled maize rhizosphere and bulk soils from the 25-year (1990e2015) long-term fertilizer experiment
B为土体土壤，R为根际土壤。样品经三次重复分析。
土体土壤固氮类群的OTU丰富度和相对丰度
OTU richness and relative abundance of diazotrophic taxa in bulk soil
在土体土壤中，所有的施肥处理都显著减少了OTU的数量 (p< 0.05) (图. 4)。N、NCa、NPK和NPKCa处理之间无显著差异(图 4)，说明施用生石灰并不能缓解N肥的抑制作用。进一步的相关分析表明，OTU的数量与TN和NO3--N呈显着负相关(p< 0.05)。
图 4 25年（1990-2015年）长期施肥实验中所有分析的土体土样品中可操作分类单位的数量
Numbers of operational taxonomic units across all of the analyzed bulk samples from the 25-year (1990e2015) long-term fertilizer experiment
数据为均值±标准差(n=3)。不同字母表示不同施肥处理之间的差异显著(p<0.05)。
利用NCBI中的BLAST算法，将所有处理中的OTUs分类为不同的属。图5显示了六种肥料处理的土体土壤中9个相对丰度超过1%的最丰富的属。其中以Bradyrhizobium最为丰富，占全部土体土壤样品nifH总基因序列的47.7% ~ 69.9%。不同施肥处理改变了这些主要属的相对丰度 (图. 5)。与对照相比，N和NPK均显著增加了Methylosinus属的相对丰度(p<0.05)，同时降低了Bradyrhizobium，Rhodopseudomonas，Xanthobacter，及Caenispirillum属的相对丰度。生石灰(NCa和NPKCa)的添加缓解了Bradyrhizobium属相对丰度的下降，但对其他四属无显著影响。PK处理显著降低了Bradyrhizobium和Azovibrio 属的相对丰度(p<0.05)，但提高了Rhodopseudomonas，Caenispirillum，和Phaeospirillum属的相对丰度。此外，Phaeospirillum和Azospirillum在NPK处理中最丰富，生石灰(NPKCa)的加入降低了它们的相对丰度。
图 5 在所有分析的25年(1990-2015)长期肥料试验的土体土壤样品中9个最丰富属(>1%)的相对丰度(%)
Relative abundances (%) of the nine most abundant genera (>1%) across all of the analyzed bulk soil samples from the 25-year (1990-2015) long-term fertilizer experiment
数据为均值±标准差(n=3)。每个属的柱上的不同字母表示不同施肥处理之间的差异显著(p<0.05)。
固氮群落结构与土壤变量的相关性
Correlation between diazotrophic community structure and
soil variables
Mantel检验表明，土体土壤中的固氮群落结构与多种土壤变量密切相关(p<0.01 or *p*<0.05)，相关系数变化趋势为:C/N > NH4+-N > AK > NO3--N> AP > TC > SOC > DOC > pH。基于选择的土壤变量和OTU组成，使用冗余分析进一步分析了土壤性质对固氮群落结构的影响 (图. 6)。这些土壤变量解释了82.8%的变异，前两个轴解释了总变异量的64.0%和9.9%。根据向量，CK和PK处理的固氮群落均与较高的pH值相关，并且PK处理也与C/N和AK呈正相关。另外，较高浓度的TC，SOC和DOC对NPK处理的固氮种群有积极影响，而NO3--N和NH4+-N对N和NCa处理的固氮种群有积极的影响。这些土壤变量也与大多数丰富的属相关。
讨论
长期无机施肥影响土壤固氮丰度和OTU丰度
Long-term inorganic fertilization influenced soil diazotrophic abundance and OTU richness
长期施用无机肥料会降低土壤微生物的丰度。相似地，氮肥(如N和NPK处理)的投入降低了土壤固氮丰度(图. 2)，可能是由于土壤酸化或高氮含量的负反馈作用。在一些长期试验中，微生物丰度对低土壤pH值的负响应已经得到了很好的证明，这使得土壤pH值被认为是影响土壤微生物丰度的决定性因素。因此，本试验的结果与预期一致(表 2)，其中25年的无机氮肥投入导致土壤酸化加剧(表 1)。此外，添加生石灰后固氮丰度的显著增加进一步支持了这一解释(图 2)。氮源是生物体生长和代谢所必需的，但氮的富集通常会导致土壤固氮丰度的降低。在长期氮投入下，高的土壤NO3--N和NH4+-N含量显著抑制固氮群落成员，表明与固氮丰度呈显著负相关(表 2)。相比之下，在没有N (CK和PK)的处理中，长期N缺乏会导致更大的C/N比(表 1)，导致自由生活的固氮菌具有竞争优势。此外，PK处理下固氮丰度高于CK处理下的固氮丰度，这可能归因于P的积极作用，P具有潜在的生物固氮作用。这解释了固氮丰度与C/N和AP含量之间呈正相关的原因(表 2)。因此，固氮丰度的急剧变化可能是肥料作为养分的直接作用和土壤pH值变化的间接影响(这是长期无机肥施用的结果)的综合结果。
在某些农业土壤中，氮肥的增加导致细菌OTU丰富度和固氮多样性的降低。土壤pH通常被认为是一个主要的影响因素。然而，我们观察到在所有处理中固氮OTU含量均下降(图 4)，OTU丰富度与TN和NO3--N之间呈显着负相关，这表明在长期进行无机施肥时，土壤养分与pH对降低固氮OTU的丰富度的作用同等重要。同样，Zeng等人(2016)报道，在高氮输入下，土壤养分直接导致了农田表层土壤细菌OTU丰度的降低。对土壤pH值的关注可能是由于氮素输入与土壤pH值的高相关性掩盖了氮素效应。在本试验中，当添加生石灰,土壤pH值增加后，固氮OTU的丰富度并没有增加(图 4)，这证实了土壤pH可能不是降低固氮OTU丰富度的主要因素。因此，即使土壤pH值短暂恢复到对照水平，长期无机施肥所消除的固氮细菌的某些种类也难以恢复。
长期无机施肥改变了固氮菌的群落结构
Long-term inorganic fertilization changed the diazotrophic community structure
长期施用无机肥料，特别是氮肥，改变了土壤微生物群落结构，包括总体和氧化氨细菌、真菌和氧化氨古细菌的水平。不出所料，在长期无机施肥的作用下，固氮群落组成发生了变化(图 3)。首先，含N处理与不含N处理(PK和CK)的固氮群落组成之间存在显著差异，表明与P和K相比，N对土壤固氮群落结构的影响更大。同样，Coelho等人发现氮肥是固氮群落结构的决定因素。微生物群落结构的形成是一个复杂的过程，需要多个土壤变量的协同。氮输入带来的高的氮的有效性直接影响微生物群落结构。同样，在其他研究中也观察到，与氮有关的土壤特性(包括NO3--N，NH4+-N和C/N)是影响固氮群落结构的最主要因素(图 6)。此外，土壤AP和AK是另外两个重要因素，增加了固氮群体在PK和NPK处理下的数量(图 6)。因此，土壤养分有效性(取决于肥料提供的元素)对固氮群落结构的形成至关重要。
除了土壤养分有效性外，长期无机施肥还增加了土壤有机C含量(表1)，这证实了该试验区以前的研究结果以及其他长期试验的结果。在本试验中，土壤有效碳库也影响固氮群落结构(图 6)。Cusack等报道了土壤有机质数量和质量的变化与不同施肥方式下土壤微生物群落的变化有关。事实上，农业管理中的平衡施肥可以维持和增加土壤的C有效性(TC、SOC和DOC)(表1)，这导致了NPK和N肥处理下固氮群落的差异(图 6)。例如，几种主要的固氮属(Phaeospirillum和Azospirillum)表现出积极的TC、SOC和DOC响应。因此，农田生态系统通过平衡施肥提高了农业产量，从而形成了由C源诱导的相关微生物群落。在许多生态系统中，土壤pH值已经被很好地研究过，并且常常被认为是细菌群落结构的一个重要决定因素。然而，在目前的研究中并没有观察到这种决定性的作用，在这种情况下，土壤pH值与上述讨论的土壤养分有效性相比不那么重要。在其他长期施肥试验中也观察到类似的结果。此外，大多数丰富属与土壤有效养分密切相关，而与土壤pH值无关。因此，固氮群落结构对长期无机施肥的响应机制可能不同于铵化菌和硝化菌，后者更容易受到土壤pH值变化的影响。这可能归因于土壤类型和养分以及微生物种群的差异。最近，Xun等人报道了施用生石灰后，NPK处理下整体细菌群落组成的显著变化，而另一项研究发现，在长期施肥试验中，短期添加生石灰不会显著改变细菌群落。同样，在目前的研究规模下，我们没有观察到固氮群落在添加生石灰和不添加生石灰的情况下的分离差异(图 3)。这一结果进一步证实了长期无机施肥所产生的土壤养分对土壤固氮群落结构的影响大于土壤pH值。
优势固氮属对长期无机施肥的响应
Responses of dominant diazotrophic genera to long-term inorganic fertilization
虽然固氮菌的分类已被广泛研究，但目前对于长期施肥条件的影响知之甚少。具体固氮属对长期无机施肥的反应差异很大，主要取决于施肥类型(图 5)。由于不同固氮属对不同养分和土壤pH值的适应能力不同，施肥会改变其竞争力。在本试验中，虽然Bradyrhizobium(通常被称为共生固氮细菌)在所有处理下的相对丰度都显著降低，但它们可能在酸性土壤的固氮中发挥重要作用，因为它们的数量最多(图. 5)。同样，Rhodopseudomonas， Xanthobacter， Caenispirillum， 及Methylosinus属的相对丰度对氮肥输入有明显反应，而不是生石灰的施用，表明它们对氮非常敏感。这些结果与之前的研究一致，即低含量的无机氮源抑制了Bradyrhizobium、Rhodopseudomonas和Methylosinus的生长。然而，PK处理选择性地刺激了一些固氮菌属，包括Rhodopseudomonas， Caenispirillum，及Phaeospirillum (图 5)，这在其他实验中也被发现了。每个属对肥料类型的不同响应可能直接导致固氮群落结构的变化。
长期无机施肥对根际效应的影响
Impact of long-term inorganic fertilization on the rhizosphere effect
根际是一个复杂的环境点，植物生长通常通过影响与土壤变量的相互作用来影响土壤微生物群落。植物根系释放的多种有机分泌物可以刺激微生物种群的生长，从而在根际形成相应的微生物群落组成。根际固氮种群丰度的增加在各种环境条件下已被广泛报道。正如所料，我们观察到在所有处理中，根际总固氮丰度都大于土体土壤(图 2)，说明根际土壤生物固氮水平较高。本试验根际土壤有效碳含量较土体土壤高，有效氮含量较土体土壤低，对固氮丰度有显著的正向影响(表 2)。同样，前人的研究表明，根系分泌物的释放和土壤养分的吸收是由植物生长引起的，刺激了生物固氮。
不同施肥处理之间植物生长的显著差异可能影响植物与土壤微生物种群之间的关系。本试验中根系对土壤固氮群落的影响与前人研究结果不一致。一些论文报告说，植物可以驱动给定地点或土壤类型内固氮群落的明显变化。我们在另一个短期培养实验中也得到了类似的结果(数据未发表)。而Ai等人认为，长期施肥增加了土壤养分有效性，降低了根际微生物对植物的依赖。在本试验中，与施肥处理相比，根系效应对固氮群落几乎没有影响(图3)。同样地，Poly等人和Reardon等人也发现氮肥对固氮群落结构的影响大于作物对其的影响。Cotta等人也发现土壤类型及其相关特征对土壤固氮群落的影响远大于根系效应。长期施肥可形成高度专门化的土壤特性和物理上不受干扰的土壤环境，这在一个生长季节内不受植物的显著影响。本试验的土壤性质分析支持了这一观点，其中肥料处理的影响大于植物因素(表 1)。植物与微生物相互作用的具体机制是复杂的，需要进一步研究，特别是长期暴露于不同的肥料处理下。
结论
本研究表明，25年的无机施肥对土壤固氮种群产生了很强的选择力。N对固氮菌的影响可能大于P和K。在氮肥处理下较低的固氮丰度，可能会降低生物固氮能力。生石灰的施用可以通过增加土壤固氮丰度来改善酸性土壤的生物固氮，尽管它们对固氮群落组成和OTU丰度的影响不显著。固氮丰度、群落组成和OTU丰度对土壤特征的不同响应模式揭示了固氮群体对长期无机施肥适应的复杂机制。平衡施肥和控制土壤酸度可能在提高生物固氮方面发挥重要作用。对于整体群落组成而言，施肥处理比根际效应影响更大，尽管根际固氮丰度显著增加。未来的研究将确定哪些根系分泌物能更有效地调节固氮丰度的增加，如果施用能刺激土壤生物固氮，则可减少所需的无机氮肥投入。
材料与方法
实验场地及取样
Experimental site and sampling
施肥试验始于1990年，地点位于中国湖南省祁阳红壤实验站(26°450’N, 111°53’E)。场地土壤来源于第四纪红粘土，属铁铝始成土。每种肥料处理的面积大小为20m*10m，并设计有两个重复样地。夏玉米(Zea mays L. Yedan 13)和冬小麦(Triticum aestivum L. Xiangmai 4)按年轮作。耕作方式为常规耕作。无机肥料使用尿素(300kg N ha-1 year-1)，过磷酸钙(53 kg P
ha-1 year-1) 和氯化钾(100 kg K ha-1 year-1)。先前已经描述了原始的土壤特性，施肥方法，自然环境和田间管理。播种前，在10 cm的深度上捆扎肥料。每年的化肥投入中，小麦占30%，玉米占70%。由于使用N和N+P+K(NPK)肥料的地块表现出严重的土壤酸化作用，因此在2010年，这两个地块分别分为两个部分。一部分保持与以前相同的施肥，而另一部分还根据相同的施肥规程施用了2550 kg ha -1的生石灰，随后在2014年又添加了1500 kg ha -1的生石灰。在这个试验中，选择了六种不同的肥料处理:不施肥对照(CK)、仅施无机氮肥(N),无机N肥加生石灰(NCa),无机磷+钾肥(PK),无机NPK化肥、无机NPK肥加生石灰(NPKCa)。
土壤采样时间为2015年6月12日(玉米开花期)。每种肥料处理均在3个3m*3m的子小区中随机建立。由于每个处理中都有两个重复的小区，所以从一个重复小区中随机选择两个副小区，从另一个小区中随机选择另一个副小区。收集每个副小区5个玉米植株的根际土壤(深度0-15cm)，将这5个样本混合成一个土壤样本。用铁锹把每棵植物的根轻轻从农田里移走，把附着在根上的土壤汇集起来，作为根际土壤。土体土壤取自不受根系干扰的区域，不含从根系脱落的土壤。每一土体土壤样本收集自每个副小区的5个土壤岩心(深度0-15cm，直径2cm)。收集到的每个样品都经过2毫米的筛孔，均质彻底，并分成两部分。一部分用于土壤性质分析，另一部分用于DNA提取，应立即保存在-80°C。
每棵植株的嫩枝和根同时收获，用蒸馏水洗三次，彻底去除吸附的土壤颗粒。然后，将它们分别放入信封中，在70°C的温度下烘干，以获得植物的干重。
土壤性质分析
Soil property analysis
对风干土壤进行了pH、总碳(TC)、总氮(TN)、土壤有机碳(SOC)、有效磷(AP)和有效钾(AK)的测定。新鲜土壤样品被用来测定土壤
铵(NH4+-N)，硝(NO3--N)，可溶性有机 碳(DOC)和有机氮(DON)。用pH计(Mettler Toledo FE20, Shanghai, China)测定去离子水(土壤:水，1:2.5)中的土壤pH值。使用硫酸重铬酸钾氧化法测量SOC。用Vario MAX CNS元素分析仪 (Elementar, Hanau, Germany)测定TC和TN。用0.03 M盐酸氟化氢铵提取AP，按Bray法测定。用1.0 M乙酸铵提取AK，火焰光度法测定(FP640; Shanghai, China)。用2.0 M KCl萃取NH4+-N和NO3--N并用连续流动分析仪测量 (Sanþþ, Skalar, Holland)。用0.5 M K2SO4萃取DOC和溶解性总N (DTN)，分别用总有机碳分析仪(Multi N/C 3000; Analytik, Jena, Germany)和凯氏定氮法测定。DON的计算如下:DTN - NH4+-N。用重量法测定了土壤含水量。
土壤DNA提取与nifH基因丰度定量
Soil DNA extraction and quantification of nifH gene abundance
使用Fast®DNA SPIN Kit (MP Biomedicals, CA, USA)从0.5g土壤(鲜重)中提取土壤DNA，随后使用PowerClean®DNA Clean-up Kit (MoBio, CA,
USA)按照制造商说明进行纯化。每个土壤样本包含三个连续的DNA提取，三次重复的DNA被合并为一个DNA样本。用NanoDrop ND-1000分光光度计(NanoDrop Technologies, Wilmington, USA)测定提取的DNA的浓度和质量。
采用实时定量PCR (real-time quantitative PCR, qPCR)方法，在LightCycler 480 real-time PCR (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)上用SYBR®Premix
Ex Taq™ (TaKaRa Bio, Dalian, China)测定nifH基因拷贝数。采用nifH基因特异性引物PolF/PolR进行qPCR扩增。qPCR程序和反应组成正如Sun等人描述的那样。用熔融曲线分析扩增产物的特异性。为获得标准曲线，将nifH基因片段克隆到pMD19-T载体(TaKaRa Bio)中，随后转入大肠杆菌DH5a感受态细胞。选择和验证包含正确片段长度的质粒。以质粒纯化试剂盒(TaKaRa Bio)提取的质粒DNA为模板，生成标准曲线。每个DNA样本一式三份。根据Mirza等(2014)的研究计算拷贝数和PCR扩增效率。效率为89.1%，R2值为0.99。
nifH基因测序及生物信息学分析
nifH gene sequencing and bioinformatics analysis
：采用巢式PCR方法扩增nifH基因片段进行焦磷酸测序。引物组PolF / PolR和RoeschF / RoeschR分别用于第一次和第二次PCR扩增。PCR程序和反应组成正如Pereira e Silva等人(2013)描述。为了区分样品，在第二次PCR扩增时，正向引物中加入了一个样品特异性标记(7-bp条码)。对每个样品进行三次重复的PCR扩增，并合并为PCR产物。然后，使用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒(TaKaRa Bio)对纯化的扩增子进行定量，并按等摩尔比组合。扩增子文库的测序是在具有300 bp配对双端读数长的Illumina MiSeq平台上进行的。测序数据已存入 NCBI Sequence Read Archive (SRA) 数据库，登录号为SRP092284。
首先将来自原始数据的成对读长与FLASH版本1.2.7合并，其中正向和反向读长的重叠碱基长度≥10 bp，并且不允许碱基错配。测序读长用Mothur版本1.31.1处理。质量得分<20、含有不明确核苷酸或与引物和条形码不匹配的低质量序列被删除。根据条形码对样品序列进行分类后，去除条形码和引物序列。利用the FunGene Pipeline of the Ribosomal Database Project server(http://fungene.cme.msu.edu/FunGenePipeline/)，将剩余的序列进一步转化为氨基酸序列。翻译蛋白与nifH蛋白序列不匹配或含有终止密码子的序列被丢弃。将剩余的序列与nifH基因数据库进行比对，剔除比对的失败序列和嵌合序列。在Huang et al.(2016)和Pereira e Silva et al.(2013)的研究基础上，将剩余的高质量序列以90%的一致性分组为操作分类单元(operational taxonomic units, OTUs)。利用GenBank中(http://
blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)基于BLAST算法的搜索对OTUs中的代表性序列进行分类。
数据分析
Data analysis
使用Windows的SPSS 18.0版执行统计分析(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)。使用单因素方差分析（ANOVA）确定了肥料处理之间玉米生物量，OTU数量和相对丰度的差异，并使用Duncan’s检验进行了多重比较(p<0.05)。采用双因素方差分析来评价施肥处理和根系效应(土体与根际)的互作效应对土壤性状参数和总基因丰度的影响。当处理间交互因素达到显著性差异(p < 0.05)时，采用单因素方差分析或学生t检验分析差异程度。Pearson相关系数用于检验土壤性状、nifH总基因拷贝数、OTU数与相对丰度之间的关系。
为了计算群落相似性，我们通过使用R软件(Version 3.1.2)的vegan包进行了基于otu的算术平均数的未加权对分组法的层次聚类分析，基于Bray-Curtis距离矩阵的非度量多维尺度(NMDS)，以及相似性分析(ANOSIM)。采用Mantel检验确定群落组成与各土壤变量之间的相关性。只有Mantel检验有显著影响的变量(p<0.05)被进一步使用R软件进行冗余分析。
编译：马腾飞 南京农业大学
责编：文涛 南京农业大学
审核：刘永鑫 中科院遗传发育所
Reference
Chao Wang, Manman Zheng, Wenfeng Song ,Shilin Wen,Boren Wang,Chunquan Zhu,Renfang Shen. Impact of 25 years of inorganic fertilization on diazotrophic abundance and community structure in an acidic soil in southern China.Soil Biology and Biochemistry 113 (2017) 240e249 http://dx.doi.org/10.1016/j.soilbio.2017.06.019
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