【生化】Angew：基于化学反应的传感方法用于检测活细胞中的环氧合酶-2
环氧合酶（COX，EC. 1.14.99.1）是花生四烯酸（AA）合成前列腺素的关键限速酶。人类的COX主要存在两种同工酶（COX-1和COX-2）：COX-1在大多数下细胞类型中组成性表达，而COX-2可根据组织类型组成性或诱导快速产生前列腺素。前列腺素是一类具有生理活性的不饱和脂肪酸，广泛分布于身体各组织和体液中，其通过对脂质的调节影响着生理过程的发生，如胃上皮细胞的保护、止血和钠代谢。除此之外，COX-2过表达与炎症、神经退行性疾病和癌症息息相关。然而，目前用于生物系统中COX-2的检测方法十分有限。
近日，美国伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校化学系的Jefferson Chan教授基于化学反应的传感（activity-basedsensing，ABS）设计合成了荧光探针CoxFluor，其利用COX活性位点的大小和动力学上细微的差异实现同工酶的选择，成功应用于活细胞中COX-2的检测。ABS主要指利用动态分子反应性实现传感器在复杂环境中对分析物的高选择性检测，具有高的特异性、精确的信号输出以及对复杂环境的高耐受性。相关成果以“An Activity-based Sensing Approach for the Detection of Cyclooxygenase-2in Live Cells”为题发表在Angew. Chem. Int. Ed.上（DOI: 10.1002/anie.201914845）。
CoxFluor由AA和3,7-二羟基苯噁嗪通过可裂解的酰胺键连接而成。作者猜测脂质尾巴以类似于AA的方式充当COX-2的底物（Scheme 1a）。结合到COX活性位点后，探针经过双氧合和环化反应产生CoxFluor-PGG2中间体，随后转移至过氧化物酶活性位点并被化合物Ⅰ或Ⅱ氧化，产生不稳定的试卤灵自由基并发生歧化和酰胺水解反应，从而释放荧光产物以及PGG2或PGH2（还原态，Scheme 1b）。
（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）
CoxFluor的合成从锌介导的刃天青的还原开始，然后用乙酸酐进行乙酰化，以63%的收率得到中间体1。随后，1在碘化钾的作用下和花生四烯酰氯偶合得到化合物2。最后，2在甲醇钠（原位生成）的存在下脱去保护基团乙酰基，以68%的收率得到CoxFluor，四个步骤的总收率为21%（Scheme 2）。
（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）
首先，作者评估了CoxFluor对于重组人COX-2的反应。在COX-2的作用下，CoxFluor裂解产生试卤灵（573 nm，ΦF=0.55）和PGG2，且荧光增强约41倍（Figure 1a）。为了确认该结果是酶催化氧化引起的而不是由过氧化物酶活性产生的，作者用饱和脂质尾巴（花生酸）代替AA脂质合成了对照化合物Ctrl-CoxFluor。幸运的是，在相同条件下Ctrl-CoxFluor并没有发生反应（Figure 1b），这说明CoxFluor的荧光增强是酶催化的结果。另外，作者测得CoxFluor氧化成试卤灵的kcat为19 min-1，Km为22 μM（Figure 1c）。随后，作者发现吲哚美辛和塞来昔布均可抑制CoxFluor的荧光响应（Figure 1d），这使得鉴定或评估COX-2的抑制剂变得更加便捷直观。
为了评估COX-2是否存在脱靶激活效应，作者选择了一组具有相关活性的酶（脂氧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶等）进行测试，其可以裂解酰胺键（酯酶）或能够代谢AA类似物（细胞色素P450s）。令人欣喜的是，即使在10倍酶的存在下，CoxFluor仍显示出良好的选择性（Figure 1e）。同样的，在活性氧、活性氮或者其他细胞氧化剂/还原剂的存在下，CoxFluor也没有表现出荧光增强（Figure 1f）。
（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）
为了进一步研究COX-2激活CoxFluor的机制，作者采用了分子对接和分子动力学（MD）计算。作者将CoxFluor沿着模拟轨道停留在每个角度中以探究最有可能的结合方式。结果表明，与COX-1相比，除了数量和区域的区别之外，COX-2的环氧合酶活性位点与CoxFluor有很好的结合（Figure 2a-c）。通过结构比较，作者也发现CoxFluor可以在环氧合酶活性位点以适当的方式结合并发生氧化反应（Figure 2d）。
（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）
接下来，作者将CoxFluor用于RAW 264.7鼠巨噬细胞中内源性COX-2活性的检测和成像。作者用脂多糖（LPS）诱导产生炎症模型，从而检测COX-2和随之生成的前列腺素的表达。根据共聚焦的拍摄照片及荧光半定量分析结果可知，用LPS刺激后的细胞，其荧光强度约为对照组的1.6倍（Figure 3）。
（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）
最后，作者致力于研究是否可以调节COX-2活性高于蛋白水平。作者猜测氧气可与铁血红素辅基结合而影响COX-2的活性。因此，作者在常氧（～21%）及缺氧（<0.1%）条件下用流式细胞仪检测RAW 264.7巨噬细胞的荧光变化。有趣的是，在缺氧条件下，COX-2表现出更高的活性（Figure 4a-c）。此外，用吲哚美辛处理的细胞的荧光强度同比降低了12%，说明荧光的增加是COX-2依赖性的（Figure 4d）。为了评估氧气的剂量依赖性，作者在1%和0.1%的氧气氛围下重复实验，并观察到COX-2活性的氧依赖性降低（Figure 4d-e）且与蛋白表达水平无关（Figure 4f）。该结果充分表明局部的细胞微环境在COX-2活性的调节中起着关键作用。
（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）
总而言之，作者利用ABS方法合成了第一个用于检测COX-2活性的同工型选择性探针CoxFluor，证明了COX-2活性可以通过活细胞内的氧分压进行调节，为研究和评估COX-2在活细胞中的作用提供重要的帮助。
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