【文献精读】AD病理性小胶质细胞通过细胞外囊泡途径加速Tau扩散

      小胶质细胞是中枢神经系统的免疫细胞，具有许多特殊的作用，包括突触修剪，释放促炎和抗炎细胞因子，以及检测和吞噬病理损伤。最近的研究表明，小胶质细胞有助于阿尔茨海默病的tau蛋白病理进展。淀粉样斑块的积聚将大脑中的初级先天免疫细胞小胶质细胞转化为神经退行性小胶质细胞(MGnD)，其表现出对斑块、凋亡神经元和含有聚集及磷酸化tau蛋白的营养不良神经突的吞噬作用增强。近日，波士顿大学Kevin Clayton团队在 Molecular Neurodegeneration 杂志发表了题为“Plaque associated microglia hyper-secrete extracellular vesicles and accelerate tau propagation in a humanized APP mouse model”的研究论文，该研究团队将表达P301L tau突变体(AAV-P301L-tau)的腺相关病毒立体定向注射到5月龄C57BL/6 (WT)和人源化APP突变体敲入纯合子 (App^NL-G-F) 小鼠的内侧内嗅皮层(MEC)以及给小鼠喂食含有集落刺激因子-1受体抑制剂 (PLX5622) 的饲料以敲除小胶质细胞，作者发现MGnD小胶质细胞在压实Aβ斑块和清除NP tau的同时过度分泌p-tau⁺EVs，并且认为这是淀粉样斑块沉积和App^NL-G-F小鼠中tau增殖加剧之间的一种新的机制联系。

     WT和App^NL-G-F这两组小鼠在喂食含PLX5622的饲料2个月后，IBA1几乎完全不存在(> 93%) (图 1a-c)。此外，总的P2RY12+面积在WT和App^NL-G-F小鼠之间没有统计学差异，后者也被PLX5622耗尽 (图 S1A-B)。在AD脑中，小胶质细胞响应淀粉样病变而被激活，并迁移到它们压实和吞噬Aβ斑块的区域。硫黄素-S染色显示在小胶质细胞减少后，Aβ斑块的致密度明显降低 (图 1d-e)，并且总体Aβ斑块面积、数量和大小显著增加 (图 1e)。硫代黄素-S 斑块的 3D 表面渲染显示球形度显着降低，斑块体积和面积增加（图 S1C-D）。这些发现主要在4G8的弥漫性淀粉样蛋白染色中重现 (检测 Aβ17–24，图 1f-g)，特别是在斑块大小和斑块总面积方面。用另一种抗体82E1对弥漫性淀粉样蛋白的免疫荧光显示，在相同的大脑中，小胶质细胞耗尽后，斑块病理学没有差异 (图 1h-i)。此外，82E1具有与4G8不同的染色模式 (图 S1E)。82E1抗体检测aβ1–16，常用于评估小胶质细胞耗竭对淀粉样蛋白负荷影响的研究 。此外，针对GFAP的免疫荧光显示，小胶质细胞耗竭对WT小鼠的星形胶质细胞增生没有影响 (图 S1F-G)。与未受PLX5622治疗影响的WT小鼠相比，App^NL-G-F小鼠中Aβ斑块周围的星形胶质细胞增多 (图 S1F-G)。总之，这些结果表明，小胶质细胞在4-6个月大的App ^NL-G-F小鼠中Aβ斑块的数量和致密度中发挥着重要作用。

图1 给药PLX5622耗竭了小胶质细胞并增加淀粉样斑块负担

图S1 小胶质细胞减少对App^NL-G-F小鼠斑块沉积和星形胶质细胞增生的影响

    P-tau的传播如图 2a。AAV2/6 P301L MAPT突变体(AAV-P301L-tau)的假型突触素-1启动子驱动的转基因表达如前所述，在5月龄的App^NL-G-F和WT小鼠中注射到MEC (图 2a)。注射AAV-P301L-tau后，在MEC和GCL的App^NL-G-F小鼠和WT小鼠中观察到DG的强AT8⁺细胞胞体染色 (图 2b)。并且在WT和App^NL-G-F小鼠中的门和CA1区域发现了AT8⁺细胞 (图 S2A-B)，这表明p-tau不仅通过穿孔途径繁殖，还可能通过从EC层II投射到CA1的临时途径繁殖。这些结果与先前显示淀粉样斑块对tau传播的增强作用的报告一致。值得注意的是，小胶质细胞耗竭有效地抑制了两组中tau的繁殖 (图 2c)，而与WT小鼠相比小胶质细胞耗竭对tau繁殖的抑制作用在App^NL-G-F中更加突出。

     除了AT8⁺神经元，还研究了与神经突起斑相关的AT8⁺tau沉积(NP tau)。最近的一项研究证明小胶质细胞参与了NP tau的发育。我们研究了AAV-P301L-tau增殖对小胶质细胞耗竭或不耗竭的App^NL-G-F小鼠中NP tau形成的影响。在 AAV-P301L-tau 在 MEC 中孵育后，AT8⁺NP tau 周围斑块增加，小胶质细胞耗竭进一步显著增强（图 2d-e）。在海马体中，注射和小胶质细胞耗竭后，NP tau的比例显示出相似的模式，但差异不显著 (图 S2C)。这表明在MEC表达的tau也可以扩散并结合到NP tau中，NP tau可能被斑块相关的小胶质细胞主动吞噬。这些数据证明Aβ沉积以小胶质细胞依赖的方式加剧了tau的繁殖。

图2 Aβ沉积以小胶质细胞依赖的方式加速tau的增殖，而小胶质细胞竭耗则增强NP tau的形成

图S2 在WT和App^NL-G-F小鼠中注射AAV-P301L-tau后tau的增殖评估

图3 携带淀粉样蛋白的大脑中突触标记和EV释放信号增加

图S3 流式细胞术分离衰老App^NL-G-F小鼠Cd11b^hi Ly6c^lo Fcrls⁺ Clec7A^± 小胶质细胞的门控策略

图4 慢病毒小胶质细胞特异性表达mE-CD9后小胶质细胞分泌EV的体内成像

    如果MGnD小胶质细胞分泌过多的细胞外囊泡（EVs）参与了大脑区域间病理性tau的播散和繁殖，应该能够观察到由小胶质细胞衍生的EVs包裹的p-tau。向4个月大的WT和App^NL-G-F小鼠的MEC双侧注射mECD9慢病毒，然后在一个月后在同一区域注射AAVP301L-tau (图 5a)。GFP免疫荧光染色以检测mE-CD9和AT8进行p-tau标记表明mE-CD9慢病毒和AAV-P301L-tau在同一区域成功共表达 (图 5b)。以Mac2⁺小胶质细胞为标志的MGnD小胶质细胞在两种小鼠中均在注射AAVP301L-tau后引发，但与WT对照小鼠相比，在App^NL-G-F小鼠中显著更普遍(图 S5A)。单个p-tau相关小胶质细胞的共聚焦z-stack图像显示，在任一组的p-tau表达区都有稳态小胶质细胞和MGnD小胶质细胞 (图 5c)。如前所述，这些小胶质细胞似乎被 mE-CD9+EV 包围。高倍率图像的渲染显示 p-tau 被小胶质细胞特异性 EV 包裹在注射 tau 的大脑区域中的稳态小胶质细胞和 MGnD 小胶质细胞周围 (图 5d )。如前所述，从共注射的脑中分离出EVs，并对其进行AT8双重免疫金标记以检测p-tau和GFP以检测膜化mE-CD9。免疫电镜捕获的EVs图像显示，有GFP+小胶质细胞特异性EVs包裹的AT8⁺p-tau  (图 5e)。MGnD小胶质细胞分泌的EVs大约是稳态小胶质细胞的三倍 (图 5f)。 此外，对这些小胶质细胞内化的p-tau及其EVs的数量进行了量化 (图 5g-h)。无论是在 WT 还是 App ^NL-G-F 小鼠大脑中，Mac2⁺ MGnD 小胶质细胞都比 Mac2^-稳态小胶质细胞显著内化并且分泌更多的 p-tau⁺mE-CD9⁺EVs。这些数据表明小胶质细胞衍生的 EVs 分布着病理性 tau蛋白的种子，这种现象因小胶质细胞表型转变为 MGnD 表型而增强。

图5 病理性tau通过小胶质细胞来源的EVs分泌

图5S WT 与 App^NL-G-F 大脑 MGnD 的产生

     与失活的小胶质细胞相比，MGnD小胶质细胞在淀粉样蛋白和tau蛋白病理反应中释放出更高水平的EVs。这些EVs似乎包含病理上的p-tau蛋白，这可能是一种解释Aβ斑块如何增强tau蛋白病理传播的潜在机制。小胶质细胞的消耗可能会通过其他机制缓解病理性tau蛋白的传播，如通过炎症小体阻止tau蛋白激酶的小胶质介导的激活。

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  校 审 / 李胜男