可能是个大萝卜，拔一拔才知道！——脂肪酸合酶新调节亚基发现之旅

十一月 BioArt植物

撰文 | 十一月

责编 | 兮

“不要放弃可重复的实验中发现的小现象，可能是个大萝卜！拔一拔才知道！”

脂肪酸合酶（Fatty acid synthases, FASs）是生物体代谢至关重要, 对于可再生资源的生产和生物燃料合成也具有生物技术方面的指导意义。在脂肪酸合成过程中，脂肪酸链被认为是通过动态变化的酰基载体蛋白质结构域在脂肪酸合酶复合体中几个酶活性位点来回穿梭逐渐加长的。在微生物中，脂肪酸的生物合成对于其生存非常关键【1】。脂肪酸合成过程中轻微的改变可能都会对细胞功能造成影响，癌症与肥胖症等疾病均与脂肪酸合成过程的异常调节相关。

在1978年，科学家们第一次从酵母中分离纯化出了脂肪酸合酶的两个亚基【2】，并且在同一年科学家们解出了脂肪酸合酶的电子显微结构，虽然当时的分辨率只有500埃【3】（图1）。随后关于脂肪酸合酶的结构生物学方面的研究进一步给出了更为精细的结构，科学家们发现脂肪酸合酶是一个有6个α亚基和6个β亚基组成的巨大的复合物，6个α亚基组成轮状中心结构，而6个β亚基组成结构两侧的拱形结构（图1）。

图1 蛋白质合酶结构（1978【2,3】年与2007年【4,5】）

2020年3月10日，马克斯普朗克生物物理化学研究所Holger Stark与Ashwin Chari两个研究组合作在Cell发表文章Discovery of a Regulatory Subunit of the Yeast Fatty Acid Synthase，发现了直接调控脂肪酸合酶活性的调节亚基并命名为γ亚基。

为了找到直接调节脂肪酸合酶的调节因子以及控制脂肪酸长链往复穿梭的决定因素，作者们首先希望能够分离出保持高生物活性以及结构均一的脂肪酸合酶的实验方案。利用之前分离高活性20S和26S蛋白酶体的实验方案【6,7】，作者们使用PEG分级沉淀以及密度梯度离心的方式以非常温和、低离子存在的条件下分离除了脂肪酸合酶（图2）。在此过程中，作者们发现每次纯化蛋白质合酶的时候都会重复出现一个20kDa左右大小的蛋白条带被同时纯化出来（图2 红框标记的位置）。这个非常玄妙的小条带，在以前对脂肪酸合酶复合物研究的四十多年过程中从未被报道过（像不像你做实验的时候突然出现的“杂带”？）。

图2 温和分离脂肪酸合酶的实验方案以及蛋白质胶图

作者们把这条蛋白条带取出来做了一个串联质谱分析，发现这个被共同纯化下来的蛋白是Tma17p。进一步地，作者们建立一个Tma17p敲除酵母品系，并且重新利用温和纯合实验方案进行了脂肪酸合酶的蛋白质纯化实验，作者们发现在Tma17p敲除的情况下那个玄妙的小条带不见了。这些结果给了作者们一个线索：Tma17p能够与脂肪酸合酶共纯化，似乎表明Tma17p可能是脂肪酸合酶的一个至今未被发现的新亚基。

由此，作者们将目光转移到了对于Tma17p与脂肪酸合酶的关系的研究之上。根据前人的研究发现，Tma17p与转录工厂的形成以及蛋白酶体的组装有关，并且在细胞遭遇胁迫的情况下表达量会上调【8-10】。通过密度梯度离心纯化的Tma17p与脂肪酸合酶所在的位置说明两者之间的相互作用是直接的。而且通过一系列对照实验，作者们确认了Tma17p的确是脂肪酸合酶的直接相互作用亚基，因此作者们将该亚基命名为γ亚基。通过调节纯化过程中盐离子等条件，作者们进一步确认γ亚基与脂肪酸合酶之间的相互作用较弱而且容易受到盐离子浓度影响，这也是之前一直未发现脂肪酸合酶复合物中该亚基存在的原因。

在确认了Tma17p的身份之后，作者们希望找出γ亚基在脂肪酸合酶复合物中发挥的功能。作者们通过实验发现，γ亚基影响脂肪酸合酶的活性尤其是还原酶活性，而且在缺乏乙酰辅酶A等底物的情况下可以延缓NADPH的周转率。另外，作者们想要知道γ亚基作为调节亚基对于脂肪酸合酶结构构象的影响。通过对脂肪酸合酶的结构进行解析，作者们发现脂肪酸合酶复合物存在两种构象：旋转构象（Rotated conformation）和非旋转构象。在加入γ亚基之后，作者们发现，脂肪酸合酶的旋转构象可以被γ亚基的结合所稳定，而且存在剂量依赖的现象，γ亚基的结合给脂肪酸合酶提供了一个动力学窗口用以调节脂肪酸合酶的酶活性（图3）。

图3 γ亚基的结合影响脂肪酸合酶的构象从而调节脂肪酸合酶的活性

Holger Stark与Ashwin Chari研究组合作的工作发现并报告了与酵母脂肪酸合酶弱相互作用的调节γ亚基，而γ亚基在这四十多年来一直未被发现与脂肪酸合酶这个重要的多酶复合物存在相关性。作者们通过研究发现γ亚基的具有调节脂肪酸合酶的酶活性的功能，并且能够稳定脂肪酸合酶旋转构象。该研究补充了大家对于脂肪酸合酶复合物结构的认知，为肥胖症等多种疾病提供了新的治疗靶点。

除此之外，也给了科研路上的研究生们一些经验：不要放弃可重复的实验中发现的小现象，可能是个大萝卜！拔一拔才知道！

（http://img4.imgtn.bdimg.com/it/u=850004409,2569443469&fm=26&gp=0.jpg）

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.034

参考文献

1. Schweizer, E. & Hofmann, J. Microbial type I fatty acid synthases (FAS): major players in a network of cellular FAS systems. Microbiol Mol Biol Rev 68, 501-517, doi:10.1128/MMBR.68.3.501-517.2004 (2004).

2. Stoops, J. K. & Wakil, S. J. The isolation of the two subunits of yeast fatty acid synthetase. Biochem Biophys Res Commun 84, 225-231, doi:10.1016/0006-291x(78)90286-3 (1978).

3. Wieland, F., Siess, E. A., Renner, L., Verfurth, C. & Lynen, F. Distribution of yeast fatty acid synthetase subunits: three-dimensional model of the enzyme. Proc Natl Acad Sci U S A 75, 5792-5796, doi:10.1073/pnas.75.12.5792 (1978).

4. Leibundgut, M., Jenni, S., Frick, C. & Ban, N. Structural basis for substrate delivery by acyl carrier protein in the yeast fatty acid synthase. Science 316, 288-290, doi:10.1126/science.1138249 (2007).

5. Lomakin, I. B., Xiong, Y. & Steitz, T. A. The crystal structure of yeast fatty acid synthase, a cellular machine with eight active sites working together. Cell 129, 319-332, doi:10.1016/j.cell.2007.03.013 (2007).

6. Schrader, J. et al. The inhibition mechanism of human 20S proteasomes enables next-generation inhibitor design. Science 353, 594-598, doi:10.1126/science.aaf8993 (2016).

7. Haselbach, D. et al. Long-range allosteric regulation of the human 26S proteasome by 20S proteasome-targeting cancer drugs. Nat Commun 8, 15578, doi:10.1038/ncomms15578 (2017).

8. Fleischer, T. C., Weaver, C. M., McAfee, K. J., Jennings, J. L. & Link, A. J. Systematic identification and functional screens of uncharacterized proteins associated with eukaryotic ribosomal complexes. Genes Dev 20, 1294-1307, doi:10.1101/gad.1422006 (2006).

9. Hanssum, A. et al. An inducible chaperone adapts proteasome assembly to stress. Mol Cell 55, 566-577, doi:10.1016/j.molcel.2014.06.017 (2014).

10. Rousseau, A. & Bertolotti, A. An evolutionarily conserved pathway controls proteasome homeostasis. Nature 536, 184-189, doi:10.1038/nature18943 (2016).

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