来源:生物骨科材料与临床研究
作者:李鹏1,2 刘慧玲1 吴康1 林潇1* 杨磊1,3*
作者单位:
1 苏州大学骨科研究所
2 兵器工业521医院骨科
3 河北工业大学生命科学与健康工程学院
文章导读
复合淀粉水凝胶具有良好的可注射性、可降解性和生物相容性,可以提升软骨细胞II型胶原基因和SOX-9基因的表达量,并可在体内促进骨-软骨缺损修复。笔者通过开发一种可注射和可降解的复合淀粉水凝胶,材料注射到关节腔中可保护关节软骨并对骨软骨缺损进行修复,具有巨大的临床应用潜力。骨组织工程支架材料除成骨性能外,其血管化也是促进骨缺损修复的重要因素。
[摘要]
目的 开发一种可注射和生物降解型的水凝胶,并研究该水凝胶对软骨细胞增殖和功能表达的影响,以及在大鼠膝关节骨-软骨缺损模型中的修复效果。
方法 以硅酸钙溶液和淀粉为主要原料加入添加剂后制备复合淀粉水凝胶,通过流变学测试、注射器推出实验和体外浸泡实验对其流变学性能、可注射性和降解性能进行表征。分离提取幼年大鼠膝关节软骨细胞并与材料浸提液进行共培养,通过CCK-8细胞增殖测试和细胞Live/Dead染色方法测定细胞毒性和活性,并通过PCR定量测试成软骨相关基因的表达量。构建大鼠膝关节骨-软骨缺损模型,通过局部注射复合淀粉水凝胶进行干预,在2周、4周和6周取大鼠膝关节标本行宏观、组织学染色评估和分析。
结果 复合淀粉水凝胶具有介于固态和液态之间的流变学特征,在15N外力下可从22G针头中稳定推出,在PBS溶液中浸泡10d后质量损失率为38wt.%。复合淀粉水凝胶浸提液对软骨细胞增殖无抑制作用,并提高了其Ⅱ型胶原基因和SOX-9基因的表达量。动物实验显示治疗4周和6周后复合淀粉水凝胶组的组织学评分高于未治疗组,组织学染色也显示该水凝胶可促进软骨细胞外基质合成。
结论 复合淀粉水凝胶具有良好的可注射性、可降解性和生物相容性,可以提升软骨细胞Ⅱ型胶原基因和SOX-9基因的表达量,并可在体内促进骨-软骨缺损修复。
骨关节炎是常见的临床疾病,严重影响患者的健康和生活质量[1]。据报道,全球约5%的人因骨性关节炎造成严重的痛苦,给患者和社会带来严重的压力和负担[2]。2016年,中国膝骨关节炎的患病率为8.1%,即大约有1.1亿的患者[3]。此外,暴力挤压或撕裂以及长期大运动量、高负荷运动均可对骨关节造成慢性磨损[4]。关节疾病周期可长达几十年并逐渐恶化,致残率可达53%[5]。
通过关节腔注射方式对关节骨-软骨缺损进行保护和修复具有巨大的临床应用潜力。目前临床上常用的医用透明质酸注射液在关节腔内降解速度过快,需要多次反复注射[6-7],而且不具备骨-软骨修复的作用。因此,亟需开发一类降解速率适中,且具有骨-软骨修复能力的可注射材料用于关节面保护和骨-软骨缺损修复。本研究目标开发一种可注射和可降解的复合淀粉水凝胶材料,并对水凝胶流变学性能、可注射性和降解性能进行研究,通过大鼠软骨细胞观察其对细胞增殖、相关基因表达的影响,最后评价该水凝胶在体内修复骨-软骨中的效果。
1 材料与方法
1.1 主要实验仪器及材料
硅酸钙(CaSiO3,中国医药集团有限公司)、玉米淀粉[(C6H10O5)n,河南建杰实业有限公司]、四水硝酸钙[Ca(NO3)2·4H2O,中国医药集团有限公司]、F-12培养基(Dojindo公司,日本)、胎牛血清(FBS,Gibco公司,美国)、流变仪(AR2000,TA. Instruments,美国)、一次性注射器(江苏正康医疗器械有限公司)、Real-time PCR扩增仪(Bio-Rad公司,美国)、倒置显微镜及成像系统(Carl Zeiss公司,德国)、全波长酶标仪(Biotek公司,美国),医用透明质酸钠(HA,日本生化学株式公社,日本)。
1.2 复合淀粉水凝胶的制备
1.2.1 硅酸钙溶液的制备
将5 g硅酸钙溶于50mL去离子水中并在37℃持续搅拌12h,然后倒入50mL无菌离心管中,以3×103rpm的速度在离心机上离心10min,取离心后的上清液倒入新的50mL无菌离心管中。用无菌过滤器过滤,即可得到无菌的饱和硅酸钙溶液(CS)。
1.2.2 复合淀粉水凝胶的制备
称量四水硝酸钙倒入饱和硅酸钙溶液烧杯中,制备0.05g/mL浓度的溶液,溶解后加入Waxy淀粉,浓度为0.2g/mL。60℃充分搅拌30~40min,直到淀粉发生糊化变为无色透明状,即得到复合淀粉水凝胶(14 CS Gel)。同时,用去离子水代替饱和硅酸钙溶液制备淀粉水凝胶(14Gel)。材料制备后用紫外线进行辐照灭菌30min备用。
1.3 测试与表征
1.3.1 复合淀粉水凝胶的流变学测试
本测试采用直径为20mm的平行板,将水凝胶样品的直径和厚度调整为20mm和1mm。流变学性能测试采用振荡模式,在37℃、1%应变下进行频率扫描测试,频率范围:0.1~100Hz,测定力学数据并记录。自愈合性能测试在37℃、1Hz频率下,1%和500%交替应变下进行时间扫描测试,测定数据。
1.3.2 复合淀粉水凝胶的注射性能
将复合淀粉水凝胶装到带有针头(内径1.6mm)的5mL注射器中,固定在力学实验机上,以10mm/min的恒定速度推注,直到以恒定的力值将水凝胶推出时结束实验,记录复合淀粉水凝胶在推注过程中的推注力随时间变化曲线。
1.3.3 复合淀粉水凝胶的体外降解测试
采用磷酸盐缓冲溶液(PBS)浸泡的方法测试复合淀粉水凝胶的体外生物降解性能。将烘至恒重的复合淀粉水凝胶样品装入15mL离心管,按照0.1g/mL浓度加入PBS溶液,然后放置在37℃恒温箱里浸泡,每2d换液,进行10d的体外降解浸泡实验,测试浸泡不同时间后复合淀粉水凝胶样品重量的变化,并计算其相对于原始水凝胶样品重量损失的百分比,将其定义为水凝胶的降解率。
降解率(%)=(W0-Wi)/W0×100%
其中,W0是复合淀粉水凝胶初始重量,Wi是浸泡不同时间时所测得的复合淀粉水凝胶重量。
1.3.4 复合淀粉水凝胶的生物相容性测试
本实验通过苏州大学伦理委员会批准(ECSU-2019000103),所需动物从苏州大学动物实验中心购买。从幼年雄性Sprague Dawley大鼠(月龄4周)髋关节提取软骨细胞。将复合淀粉水凝胶(14 CS Gel)、淀粉水凝胶(14 Gel)、硅酸钙溶液(CS)、透明质酸钠(HA)以不含胎牛血清(FBS)的F-12培养基、0.1g/mL浓度在37℃恒温箱中浸提24h,在各组材料的浸提液中加入10%FBS和1%青链霉素,与细胞共培养1d和3d,使用CCK-8试剂对软骨细胞的增殖情况进行测定。即首先将孔板中的浸提培养液移除并用PBS冲洗3次,将CCK-8原试剂与PBS缓冲液按体积比1∶10的比例配制成稀释后的CCK-8试剂,向96孔板每孔中加入110μL CCK-8试剂,然后转移至培养箱中孵育2h。2h后,每孔取100μL液体转移至新96孔板中,使用酶标仪在450nm波长下测试其吸光率(OD)值,每组重复3次,每次5个复孔。然后根据如下公式计算细胞的相对增殖率:
相对增殖率(RGR)=(A/A0)×100%
其中,A是实验组吸光度,A0是对照组吸光度。
1.3.5 Live/Dead染色观察
选用24孔板,将大鼠软骨细胞以2×104个/孔的密度种在24孔板中,每孔加入2 mL培养基。置于37℃、5%CO2浓度的细胞培养箱内培养,24h后弃去原培养基,用PBS清洗3次并加入不同材料的浸提液,放置到细胞培养箱分别培养1d和3d,再向每孔加入现配的Live/Dead染剂(VPBS∶VA∶VB=2 000∶2∶1)250 μL,避光培养20min,弃去染色剂将细胞置于倒置荧光显微镜下拍照观察。
1.3.6 逆转录PCR实验
将软骨细胞悬液按2×105个/孔的细胞密度种于6孔板中,在培养箱中培养24h后除去原培养基,分别加入F-12完全培养基、复合淀粉水凝胶(14 CS Gel)、淀粉水凝胶(14Gel)、硅酸钙溶液(CS)、透明质酸钠(HA)的浸提液。置于37℃、5%CO2细胞培养箱中分别培养1d和3d,吸出浸提液,用Trizol裂解液裂解软骨细胞,提取RNA,并做逆转录PCR检测软骨相关基因SOX-9、Col-Ⅱ、Aggrecan(Agg)的表达;Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)为内参。
1.3.7 大鼠膝关节骨-软骨缺损修复实验
将骨-软骨缺损模型大鼠分为5组,每组5只,依次是:空白对照组(Control)、复合淀粉水凝胶组(14 CS Gel)、硅酸钙溶液组(CS)、淀粉水凝胶组(14 Gel)和透明质酸组(HA),其中对照组钻孔后不放置任何材料,其他组用1mL无菌注射器在造模部位注射0.1mL的上述材料。采用重量260~280g、4月龄的大鼠,术前禁食12h、禁水4h,腹腔注射3.5%水合氯醛(0.5mL/100g)进行麻醉,大鼠重量260~280g。待大鼠麻醉后行右下肢剃毛消毒处理并铺洞巾,用无菌手术刀沿大鼠右膝髌骨内侧缘,做一约2cm的纵行切口,暴露膝髁间窝部位,用直径2mm的手动钻头做一直径2mm、深度2mm 的骨-软骨缺损,缝合韧带与皮肤。待动物苏醒后放回饲养笼饲养,保证大鼠自由活动,提供足够的水和饲料。
在术后2、4和6周,分别用过量的麻醉剂处死大鼠(10%水合氯醛10 mL/kg)。取下大鼠右膝股骨,用10%福尔马林固定标本48h,用10%的中性EDTA液浸泡标本以进行脱钙。EDTA脱钙液两天更换1次,当针刺标本无明显阻力感时停止脱钙,脱水、石蜡包埋后用石蜡切片机行5mm厚度切片。行苏木精-伊红(HE)染色、番红O-快绿染色和Alcain blue染色,并根据国际软骨修复协会(International Cartilage Repair Society,ICRS)组织学评分标准进行评分[8]。
1.3.8 大鼠膝关节骨-软骨缺损修复后软骨细胞数目比较
依据各组修复部位显微镜下的软骨细胞的椭圆状形态与数目,对修复组织进行软骨细胞计数并比较各组间的差异。
1.4 统计学方法
应用SPSS 20.0软件进行统计学分析。数据以均数±标准差表示,两组间比较采用Student'st检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 复合淀粉水凝胶的流变学特征
复合淀粉水凝胶的流变学测试结果如图1A所示。可以看出,在频率测试范围内,复合淀粉水凝胶的储能模量(G')和耗能模量(G'')接近,两者随着角频率的增加而增加。上述结果表明复合淀粉水凝胶具有介于固态和液态之间的流变学特征。
2.2 复合淀粉水凝胶的注射性能
复合淀粉水凝胶可以在15N推注力下从22G的注射器针头中流出(见图1B),该推注力远低于人手操作平均力值的上限50N,表明复合淀粉水凝胶具有良好的注射性能。
2.3 复合淀粉水凝胶的体外降解性能
水凝胶损失重量的百分比如图1C所示。结果显示,第1d时复合淀粉水凝胶降解速度较快,质量损失量达到17.9wt.%;之后复合淀粉水凝胶的降解速度减慢并呈现近似匀速降解行为,在第10d时复合淀粉水凝胶降解38wt.%。
2.4 细胞Live/Dead染色结果
共培养1d后Live/Dead染色结果如图2A所示。对照组可见红色细胞(死细胞)数量最多,细胞外形呈梭型,其次为淀粉水凝胶组,其余三组红色细胞(死细胞)数量很少,并且细胞形态正常、胞膜完整。复合淀粉水凝胶浸提液对软骨细胞活性没有明显抑制作用。
2.5 CCK-8测试结果
CCK-8检测结果如图2B所示,复合淀粉水凝胶浸提液组的软骨细胞在1d和3d的相对增殖率分别为110.44%和91.98%。
2.6 RT-PCR测试结果
Col-Ⅱ基因表达量如图2C所示。培养1d时,硅酸钙溶液组Col-Ⅱ基因表达量最高,复合淀粉水凝胶组次之,和透明质酸组之间比较差异无统计学意义(P>0.05);培养3d时复合淀粉水凝胶的Col-Ⅱ基因表达相比较对照组增加15倍,并且差异有统计学意义(P<0.001),但较透明质酸组低(P<0.001)。软骨细胞Agg基因的检测结果如图2D所示。第1d淀粉水凝胶组的促Agg基因表达效果高于复合淀粉水凝胶组和透明质酸组,而第3d时复合淀粉水凝胶组的促Agg基因表达效果有明显的下降,只高于对照组并且两者间存在统计学差异(P<0.001),与对照组相比有2倍的增加(P<0.001)。SOX-9基因表达量如图2E所示。复合淀粉水凝胶明显促SOX-9基因表达,在第1d和第3d时SOX-9基因表达量继续增加,和对照组间存在差异(P<0.05),同时和透明质酸组间也存在明显的统计学差异(P<0.01)。
图2 A. 软骨细胞在不同材料浸提液培养1 d时的Live/Dead染色(红色:死细胞;绿色:活细胞);B. CCK-8法测试不同材料的生物相容性;C.Col-II基因的表达量;D.Agg基因的表达量;E.SOX-9基因的表达量
2.7 关节骨-软骨缺损修复组织大体肉眼观察和组织学观察
术后2周时,缺损处形貌和组织学分析如图3所示。宏观肉眼观察可见各组骨-软骨缺损依然明显,未见明显修复和愈合。复合淀粉水凝胶组表现出更多的新生组织长出,组织学可见新生组织含有更多蛋白多糖等软骨细胞外基质成分,其修复效果要好于对照组、淀粉水凝胶组和硅酸钙溶液组。
图3 A. 术后2周时大鼠骨-软骨缺损的修复形貌;B. 术后2周时修复组织的HE染色、番红O-快绿染色和Alcain blue染色
术后4周时,空白对照组和硅酸钙溶液组的新生组织较其他组少,空白对照组的软骨表面可明显观察到环形缺损痕迹;硅酸钙溶液组新生组织表面凹凸不平、不光滑、不连续,与正常软骨交界处凹陷较深;透明质酸组软骨表面可见环形缺损痕迹,同时缺损周围的正常软骨表面可见少许磨损;复合淀粉水凝胶组的修复效果要优于空白对照组和其他组,缺损部位表面仅见到少许半环形缺损痕迹,并且缺损周围关节面光滑连续,新生组织表面光滑(见图4)。因此,4周时复合淀粉水凝胶组的修复效果要优于其他组。
图4 A. 术后4周时大鼠骨-软骨缺损的修复形貌;B. 术后4周时修复组织的HE染色、番红O-快绿染色和Alcain blue染色
术后6周的修复结果如图5所示。空白对照组其新生组织表面略有凹陷,新生组织与周围组织的结合不紧密,周围存在继发性软骨损伤。硅酸钙溶液组缺损部位新生组织表面不平,存在数个小的圆形缺损。淀粉水凝胶组缺损已经填充但不完全,可观察到环形造模痕迹。透明质酸组缺损也已经填充,但新生组织中心见到有环形浅凹陷和小裂隙存在。复合淀粉水凝胶组6周时,缺损部位得到了进一步的修复,缺损部位基本未见有凹陷,新生组织表面光滑。因此在6周时,复合淀粉水凝胶组的修复效果要强于其他组,尤其6周时间点的番红O-快绿染色可见复合淀粉水凝胶组形成的蛋白多糖要多于其他组。同时可以看出,14 Gel组的组织增生或者修复区域也非常明显。可能原因如下:①体外结果显示14 Gel可以促进大鼠软骨细胞Agg基因的表达量,本身可以加速缺损组织修复;②14 Gel本身同样具有介于固态和液态之间的流变学特征,可改善关节软骨受力环境,减轻关节软骨的磨损。
图5 A. 术后6周时大鼠软骨缺损的修复形貌;B. 术后6周时修复组织的HE染色、番红O-快绿染色和Alcain blue染色
2.8 根据ICRS组织学评估量表进行组织学评分及分析
根据ICRS组织学评估量表对2周、4周和6周时大鼠软骨缺损的组织学修复分值如图6A-C所示。空白对照组(2周:4.00±2.12,4周:11.00±0.94,6周:12.50±0.85);硅酸钙溶液组(2周:6.50±0.71,4周:11.00±0.94,6周:12.00±1.03);透明质酸组(2周:4.50±2.12,4周:13.00±0.83,6周:13.50±0.75);淀粉水凝胶组(2周:5.00±2.83,4周:12.50±1.04,6周:12.50±0.90);复合淀粉水凝胶组(2周:5.00±1.41,4周:13.50±0.62,6周:14.50±0.52)。
2.9 关节软骨缺损修复组织的软骨细胞数目结果
2周时,可以看出硅酸钙溶液组的软骨细胞数目要高于其他各组(P<0.05)(见图6D)。4周时,各组的软骨细胞数目较2周有所增加,硅酸钙溶液组的细胞数目要比其他组多,但与复合淀粉水凝胶组没有差异(见图6E)。6周时,各组间的软骨细胞数目较4周未见明显增加,并且各组间比较差异无统计学意义(见图6F)。可以发现此时复合淀粉水凝胶组的软骨细胞数目要高于其他组,但与其他组间比较差异无统计学意义。
图6 A-C. 分别为2周、4周和6周时大鼠软骨缺损修复的ICRS组织学评分结果;D-F. 分别为2周、4周和6周时大鼠软骨缺损处的软骨细胞数量
3 讨论
水凝胶材料是目前研究较多的生物材料,水凝胶材料对低分子物质具有很好的透过性,水凝胶的三维空间结构可以为细胞生长提供获取营养、气体交换和废物排泄的场所,也可以作为新的具有形态和功能的组织、器官的物质基础[9]。力学和化学微环境在关节骨-软骨的修复中起着至关重要的作用,通过关节腔内注射合适力学和化学性能水凝胶材料可以为关节骨-软骨修复构建合适的力学和化学微环境。
淀粉作为一种高分子多糖,在加热条件下会出现糊化现象,通过改性可使得淀粉凝胶的性质介于固态和液态之间[10]。淀粉在加热至预糊化的过程中加入不同的金属盐,则会对淀粉凝胶化与淀粉的结构产生影响[11]。因此,可制备出具有平衡的固态和液态力学性能的淀粉基水凝胶改善关节力学微环境。硅参与新骨形成并影响新骨的早期矿化过程,硅通过促进BMSCs的增殖和分化,进而促进成骨细胞胶原的合成[12-13]。含有淀粉的水凝胶已被用于软骨和骨组织的修复。Sá-Lima等[14]在壳聚糖-磷酸甘油酯(CGP)体系中加入淀粉来制备温敏型水凝胶,发现淀粉的掺入在不改变原CGP特征下可以改善其弹性模量和降解性,并且可以影响软骨分化和软骨基质的分泌。Faikrua等[15]用壳聚糖/淀粉/β-甘油磷酸水凝胶作为TGF-β1的载体,发现该水凝胶体系可以持续14天释放生长因子,并可在体外环境中保持软骨细胞的表型和功能。Santos等[16]将可降解的玉米淀粉和SPCL制成3D支架,可以同时培养两种不同的细胞,构建出了治疗骨缺损重建需要的微脉管系统。
本文以生物相容性好、可生物降解的淀粉及硅酸钙盐为原料,合成一种新型复合淀粉水凝胶。改进后的复合淀粉水凝胶不仅可以促进软骨细胞Col-Ⅱ基因和Agg基因的表达,也可以促进软骨细胞SOX-9的表达,但诱导Agg基因表达的效果有所降低。Gao等[17]发现硅离子通过激活Wnt途径促进间充质干细胞(MSCs)的分化,激活骨髓间充质干细胞的ALP活性、调节某些蛋白质(如OCN、RUNX2和OPN)的表达。同时硅可显著增强软骨细胞SOX-9(转录启动子区)的表达,并增加Aggrecan、Col-Ⅱ、N-cad基因和Col-Ⅱ蛋白的表达[18]。和文献报道的结果一致,本研究也发现含硅复合淀粉水凝胶可以促进大鼠软骨细胞Col-Ⅱ和SOX-9基因的表达。
本研究体外结果表明复合淀粉水凝胶有望通过微创方式注射到大鼠软骨缺损部位并黏附在骨-软骨缺损表面,体内动物实验结果直接显示复合淀粉水凝胶在膝关节注射一次可在长达6周时间内发挥生物学功能,显示出促进骨-软骨缺损修复的效果。目前临床中使用的透明质酸作用的时效性很短且不具备软骨修复能力。研究者尝试将其他材料与透明质酸联合应用于软骨修复。例如,Wang等[19]同时使用N-乙酰氨基葡萄糖-聚乳酸-羟基乙酸共聚物-透明质酸修复兔骨-软骨缺损,结果显示该组合表现出较好的骨-软骨整合,并且缺损部位再生的组织体积和小梁骨量更高。同时,基于透明质酸类润滑剂的治疗需要频繁进行关节腔注射,在使用中易引起如关节腔积液、感染、关节痛及皮肤红斑等不良反应。本研究结果显示,复合淀粉水凝胶在未来临床使用中可以减少关节腔注射频率和次数,进而降低关节腔内注射的副作用。
本研究制备出一种具有介于固态和液态之间的流变学特征的复合淀粉水凝胶,其在15N外力下可从22G针头中稳定推出,在PBS溶液中浸泡10d后质量损失率为38wt.%。复合淀粉水凝胶浸提液对软骨细胞增殖无抑制作用,并提高了其Ⅱ型胶原基因和SOX-9基因的表达量。动物实验显示治疗4周和6周后复合淀粉水凝胶组的组织学评分高于未治疗组,组织学染色也显示该水凝胶可促进软骨细胞外基质合成。因此,复合淀粉水凝胶在骨-软骨缺损修复方面具有潜在的应用价值。
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