EID-：宏病毒组技术在新发腹泻病毒鉴定中的应用
宏基因组测序在新发腹泻病毒鉴定中的应用
撰文：李杰 常熟理工学院生物与食品工程学院
责编：刘永鑫 中科院遗传发育所
写在前面
发现和鉴定新病毒以及确定新病毒与疾病的关系是预防、诊断和治疗新发病毒性传染病的首要任务。高通量测序技术突破了传统技术方法的局限，可以直接以标本中所有的遗传物质为研究对象，从而能够快速地鉴定出标本中存在的病毒，形成了一门研究特定环境中病毒群落的新兴学科：病毒宏基因组学(宏病毒组)。
传统意义上有很多用于发现新病毒的方法，如病毒分离、核酸检验、血清学试验等，但它们都有一定的局限性。但利用高通量测序发现新病毒具有信息量大、对标本所含信息无偏倚、操作较简单、检测成本较低等独特优点，使得该技术已成为目前病毒发现中最为重要的技术之一，其在病毒诊断、溯源、预警等方面具有实用意义。本文以2017年发表在《Emerging Infectious Diseases 》(IF 7.42 )上的一篇文章为例来做简单介绍。
背景
2010年入冬以来，猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异株开始在我国流行，并导致全国范围内的严重爆发，初生仔猪感染后死亡率达90%以上; 随后，可导致仔猪腹泻的新型肠道冠状病毒Delta冠状病毒(PDCoV)也被发现；冠状病毒的高变异特性目前已经成为仔猪腹泻防控的难点，给养猪业造成巨大经济损失，对养猪业的发展形成严重威胁。2017年初开始，广东部分猪场先后暴发免疫猪群新生仔猪腹泻、死亡的案例，临床发病比PEDV稍晚、死亡率稍低，实验室检测排除了常见的几种猪腹泻相关病毒感染。
研究方法
病料收集与反饲
采集来自三个猪场的32头生病仔猪排泄物用于检测常规的猪腹泻相关病毒和进行反饲实验。将20头5日龄仔猪分为四组，每组五头，其中三组实验组分别饲喂采集自三个猪场的病猪排泄物，每头饲喂5ml排泄物，一组作为对照。在接种后三天和五天每组分别剖杀2头猪进行尸检。
文库构建
将剖杀仔猪的小肠及肠道内容物制成匀浆并进行过滤，取上清用于RNA提取。提取的RNA在进行去除DNA和核糖体RNA后，通过体外随机引物反转录进行建库，测序在Illumina HiSeq平台进行。
图1 基于鸟枪法的宏转录组测序流程示意图
(A)样本收集
(B)样本的初步处理
(C)标本核酸的提取
(D)测序文库的构建
(E)高通量测序
(F)测序序列的信息分析
基因组组装
首先对测序获得的150 bp长度的双端测序序列进行质量控制后，利用短序列比对软件bwa将其比对到宿主参考基因组（susScr3）上，将未匹配的序列筛选出来。再利用wgs-assembler软件将未匹配的序列进行基因组拼接，产生unitigs。随后挑选组成序列数目较多的unitigs提交到NCBI进行blast序列匹配，寻找出潜在亲缘关系较近的可参考基因组，以其为参照将序列匹配到基因组上。最后利用samtools和bcftools将匹配信息生成为最终病原的基因组序列。
图2 基于宏转录组测序鉴定病原及基因组组装流程
基因组注释
获得的病毒全基因组序列通过在ORF finder网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/) 进行在线的开放阅读框预测，查找潜在的蛋白编码片段。我们设定最小的开放阅读框大小为150 bp，并忽略嵌套存在的开放阅读框，其他为默认参数设置。
研究结果
使用二代测序数据质量质控软件cutadapt 1.9.1对测序原始数据去除接头以及低质量序列等，得到后续可用序列170,654,027条干净数据，平均读长为125 bp，Q20以上的数据比例为96%左右。其中99.5%的序列通过短序列比对软件bwa可以比对到猪的参考基因组susScr3上。
将不能匹配到宿主基因组上的0.5%的序列筛选出来，其中相当一部分可能是疑似病原的序列。我们将这些序列利用wgs-assembler软件进行拼接，共获得了131,070个拼接片段。借助在线的BLAST分析，发现其中一部分拼接片段（3%左右）与HKU2病毒相似性较高。我们以HKU2/GD/430/2006株的基因组作为参考基因组（Lau et al. 2007），将序列进行匹配，最终可以有效覆盖基因组的98.3%，覆盖度为1051X。利用samtools软件我们生成了初始的疑似病原基因组序列。目前该全基因组序列已经提交到NCBI数据库（MF167434），我们将该病毒命名为猪肠道Alpha冠状病毒（PEAV）。在不计算其3’末端多聚腺苷酸尾巴的情况下，其全长为27,171 nt。
通过ORF finder软件对PEAV基因组进行开放阅读框预测，发现了10个可能的阅读框，包括ORF1a， ORF1b， S， E， M， N， NS3， NS7a等（图3）。其注释的ORF信息与HKU2比较类似，除了ORF3和ORF10外。共有的开放阅读框序列的核苷酸相似性为80%到98%，氨基酸相似性为87%到100%。
图3 PEAV基因组结构示意图
PEAV的结构蛋白与HKU2有比较好的序列相似性。其中S蛋白的相似性较低，核苷酸相似性只有80%，氨基酸相似性有87%。而其他的结构蛋白相似性比较高，核苷酸相似性有93%～98%，氨基酸相似性有94%～100%。非结构蛋白的相似性略低，其中NS3和NS7a的核苷酸相似性为89%～90%，氨基酸相似性为89%～94%。
Reference
Lang Gong, Jie Li, Qingfeng Zhou, Zhichao Xu, Li Chen, Yun Zhang, Chunyi Xue, Zhifen Wen, Yongchang Cao. A New Bat-HKU2–like Coronavirus in Swine, China, 2017. Emerging Infectious Diseases, 2017, 23(9): 1607-1609
https://wwwnc.cdc.gov/eid/article/23/9/17-0915_article PDF: https://wwwnc.cdc.gov/eid/article/23/9/pdfs/17-0915.pdf
作者简介
李杰，中山大学生物信息学博士、博士后，现任职常熟理工学院生物与食品工程学院讲师。研究领域涉及微生物基因组组装、宏基因组学、畜禽流行性疾病的流行病学、病毒与宿主相互作用、病毒遗传演化、新发病毒的分离与鉴定等。目前主持苏州市科技项目和江苏省自然科学基金青年项目各一项，获得广东省“扬帆计划”博士后扶持项目两项，参与国家自然科学基金青年项目一项。参与发表SCI论文15篇，其中第一/共同第一作者8篇。
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