真核生物含有DNA复制和基因转录的机器，很多病毒依赖于宿主实现复制和转录，因此需要一个短暂的核期确保病毒的繁殖。在真核DNA病毒中，痘病毒科家族是例外，其复制和转录都在细胞质内【1】，这就需要病毒编码因子参与成熟mRNA的产生过程。Vaccinia病毒是痘病毒家族的非致病型，常用于研究细胞质基因表达。研究表明Vaccinia病毒编码多亚单位RNA聚合酶（vRNAP）和一系列相关因子，确保病毒基因的表达。
vRNAP含有病毒早期基因编码的8个亚单位，根据分子量分别为Rpo147、Rpo132、Rpo35、Rpo30、Rpo22、Rpo19、Rpo147、Rpo18、Rpo7，与Pol II的亚单位有不同程度的同源性【2】。Rpo147、Rpo132与Pol II的RPB1和RPB2在氨基酸上具有20%的相似性。但目前缺乏vRNAP及其复合物的结构学信息。
病毒基因表达根据时间顺序分成早期、中期和晚期。感染不久，早期基因被激活，表达编码的蛋白对病毒基因组的表达和复制非常重要。痘病毒中，vRNAP能够根据DNA模版催化合成RNA，但需要其他辅助因子。病毒早期基因的转录需要异二聚体VETF，VETF与转录起始位点上游和下游的早期基因的启动子结合。VETF和Rap94合作介导vRNAP招募到启动子并转变成活跃的延伸过程。转录起始后，当新生RNA长度达到27～31nt时，加帽过程开始。加帽酶（CE）不仅参与加帽过程，而且和vRNAP、VETF、NPH-I共同作用，促进转录终止。
痘病毒的转录含有5’帽子和poly-A尾巴，与宿主细胞产生mRNA类似。帽子结构包含一个N7-甲基化鸟苷残基，通过一个反向的5’-5’三磷酸连接加到新产生的转录产物的5’端，加帽过程发生在转录起始后不久。
首先，三磷酸酶（triphosphastase，TPase）水解RNA的5’端三磷酸，生成5’端二磷酸；然后，鸟苷转移酶（guanlyltransferase，GTase）催化添加GMP；最后，甲基转移酶（methyltransferase，MTase）对GMP进行甲基化修饰。三种加帽酶（capping enzyme，CE）活性可以由三种不同的酶执行，比如真菌中；也可以由多功能蛋白质编码，如后生动物利用双功能TPase-GTase多肽和TPase执行，而很多病毒使用三功能酶执行。痘病毒的CE是D1、D12亚单位组成的异二聚体，D1是三功能酶，D12结合于D1的MTase结构域，并以变构方式刺激D1的活性【3】。虽然病毒、酵母、哺乳动物CE的结构信息已经被报道，但是在转录时CE如何与RNA底物相互作用目前尚不清楚。
近日，来自德国的Utz Fischer和Patrick Cramer合作在Cell杂志上发表背靠背文章Structural Basis of Poxvirus Transcription: Vaccinia RNA Polymerase Complexes和Structural Basis of Poxvirus Transcription:Transcribing and Capping Vaccinia Complexes，分别解析了痘病毒Vaccinia的vRNAP酶的核心及完整结构，以及转录延伸复合物、转录-加帽复合物的结构，揭示了痘病毒RNA合成和共转录修饰的结构基础。
第一篇解析了痘病毒Vaccinia的核心及完整vRNAP酶的结构，分辨率达到2.8Å。核心结构包含了vRNAP的所有核心亚单位，生化实验表明具有催化活性，能够在体外延伸RNA引物，但是在完整的双链病毒启动子控制下不能产生转录活性，证实核心酶需要额外的转录起始因子。而完整vRNAP酶结构包含所有的核心酶亚单位和VTF/CE、NPH-I、VETF-I、VETF-s、E11L、tRNAGln，能够在体外进行早期基因启动子依赖的转录起始、延伸和终止。
核心酶结构中，vRNAP的两个较大的亚单位Rpo147和Rpo132在活性中心的两侧形成裂口，亚单位Rpo35、Rpo7在聚合酶的背面形成聚集，与两个较大亚单位相互作用。Rpo147和Rpo22形成两个“颚”构成DNA双链进入裂口的途径。Rpo22和聚合酶外围的Rpo19、Rpo18结合，Rpo18从聚合酶体中微微突出形成一个“柄”，并锚定在聚合酶和Rpo19上，Rpo19则连接Rpo22。Rpo30与Rpo147的“漏斗”结构域附近的N-端相结合。痘病毒特异性转录因子Rap94仅在核心vRNAP结构中可见，其两个结构域（D2和C端结构域）与裂口对面的酶外围结合。核心酶结构中，7/8的亚单位与Pol II的亚单位具有不同程度的结构上同源性，如Rpo147、Rpo132组成聚合酶的主体，与Pol II的Rpb1、Rpb2高度相似，但两者缺少几个区域而且相对较小；Rpo35兼具Pol II中Rpb3、Rpb11两者的特征，含有类Rpb3的N端和类Rpb11的C端，不过缺少锌离子结合模体及Pol II中与Rbp12、Rbp10结合的区域；vRNAP中缺乏类Rbp12的亚单位，由Rpo35的插入螺旋占据其位置；Rpo7与Rpo35相互作用，在结构和位置上都类似Pol II的Rpb10；Rpo22结构上类似Rpb5，Rpo19结构和功能上都与Rpb6具有同源性。
然而，Vaccinia vRNAP具有独特的外围特征，其不含有Pol II的表面亚单位Rbp4、Rbp8、Rbp9、Rbp12等，而且与Pol II同源的亚单位也具有不同程度的差异。如Rpo147没有Rpb1的长链重复CTD结构域，具有一个短的C端尾巴，更加灵活；与Rpb2相比，Rpo132缺少几个小区域，包含几个插入，有一个延伸的C端尾巴，包裹在聚合酶周围，穿过亚单位Rpo19，到达Rpo147的尾部。分析显示，vRNAP表面进化出特化特征，有助于与病毒特异性转录因子结合。Rap94是痘病毒特有的转录因子，参与早期病毒基因启动子的识别和转录终止，与vRNAP表面结合。Rap94的D2结构域与Rpo147、Rpo132相互作用，结合到vRNAP“钳子”的顶部；Rap94的CTD结构域位于Rpo132的叶部。即转录因子Rap94横跨vRNAP的裂口。
完整的vRNAP酶结构包含核心酶和额外的蛋白因子E11、VTF/CE、NPH-1、VETF、Rap94，两者形成双叶结构。结构解析显示，Rap94是vRNAP核心和额外蛋白因子间作用的桥梁。Rap94的结构域分布在整个复合物上，通过延展的连接区域与各亚单位相互作用。连接域1将Rap94和NTD与D2相连；靠近Rpo18柄状结构的D2中伸出连接域2向Rpo19延伸，穿过Rpo147的C端尾巴结构，沿着聚合酶dock结构域到达vRNAP的后部；裂口的另一侧，连接域3延伸并穿过Rpo132的壁和突起区域，延伸到Rpo147的漏斗螺旋和Rap94的CTD结构域。Rap94的N端与NPH-I的C端作用，两者形成类结构域模块与VTF/CE接触；二聚体E11核心蛋白进一步加深Rap94和NPH-I接触，而Rap94的D2使tRNAGln适应核心vRNAP。此外，RAP94的核心区域类似于Pol II起始因子TFIIB；亚单位Rpo30与Pol II延伸因子TFIIS类似，且Rpo30将其磷酸化的C端尾巴置于活性中心，抑制转录复合物的形成；转录终止因子NPH-I与染色质重塑因子—SNF2家族的INO80—类似；宿主tRNAGln参与完整vRNAP的形成，有利于稳定vRNAP复合物；起始因子VETF锚定在完整的vRNAP聚合酶上。第二篇解析了Vaccinia vRNAP在形成转录延伸复合物及共转录-加帽复合物的冷冻电镜结构。转录延伸复合物（elongation complex，EC）由vRNAP核心酶和活性中心裂口中核酸组成，核心酶中8个亚单位基本没有变化。第一篇文章表明Rpo30的C端尾巴磷酸化后占据并抑制vRNAP的活性中心，但EC复合物没有病毒转录因子Rap94参与，活性中心裂口由9-bp的DNA-RNA占据。尽管vRNAP的活性位点有部分氨基酸残基与真核细胞RNA聚合酶有差异，但两者的基本机制是保守的。
vRNAP的共转录-加帽复合物（co-transcriptional capping complex，CCC）中聚合酶的构象基本与EC复合物中相同，病毒加帽酶与RNA离开聚合酶处位点相结合。病毒加帽酶（capping enzyme，CE）的亚单位D1、D12主要通过Rpo147、Rpo132、Rpo18、Rpo35与vRNAP结合，Rpo147进行变构，像弹簧一般将CE中TP/GT模体拉到聚合酶表面。CE包含2个可以相互移动的模块，一个是亚单位D1的TPase、GTase结构域组成“TP/GT模块”，另一个是D1的MTase结构域和D12亚单位组成“MT/D12模块”。MT/D12模块靠近聚合酶，D12位于RNA较近的位置，确保与转录产物进一步作用。经过模块位置重排，CE的三个活性位点都定位于RNA的附近。进一步解析发现，CE的TPase结构域与RNA 5’端稳定结合，催化5’二磷酸化的形成，随后发生GMP转移及甲基化，甲基化过程需要SAM共因子。此外，结构解析显示，Rap94和核酸的结合是相互排斥的。总的来说，两篇文章从结构角度详细阐释了痘病毒vRNAP的结构组成及与真核生物Pol II的同源性比较，并揭示了痘病毒中转录起始、延伸和加帽的结构基础，为研究病毒RNA聚合酶的转录周期提供了框架。
https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.11.023https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.11.0241. Moss, B. (2013). Poxvirus DNA replication.Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a010199.
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