【科技前沿】Protein & Cell：杨辉团队证明Retron系统在哺乳动物细胞中的可适用性

精准高效地修改DNA序列在生命科学研究、疾病治疗应用和农业发展中具有重要【1,2】。CRISPR-Cas系统的出现极大地推动了精准基因组编辑的发展。CRISPR-Cas9在Cas9诱导DNA双链断裂 (DSB) 后，通过非同源末端连接途径 (NHEJ) 在目标位点引入插入或缺失 (indel)， 或者同源重组修复途径 (HDR) 精确将供体模板DNA序列信息写入基因组DNA。理论上，通过HDR可以最大限度地将我们想要的DNA序列信息精准引入基因组【3】。而CRISPR-Cas9引起的DSB主要由NHEJ而不是HDR介导修复。研究发现使用单链DNA作为模板、提高Cas9诱导的DSB位点附近的模板DNA浓度，可以有效提高HDR的效率【4,5,6】。

细菌在与噬菌体的长期博弈中发展出了许多精妙的防御体系，其中就包括了CRISPR系统。另外，近来发现Retron系统也在细菌防御噬菌体中发挥重要作用。Retron遗传元件由一段非编码RNA (ncRNA) 和逆转录酶 (RT) 组成【7,8】。RT以ncRNA作为模板，逆转录产生与ncRNA共价连接的单链多拷贝卫星DNA（msDNA）。早在2018年，斯坦福大学Hunter Fraser研究组的研究人员开发的CRISPEY (cas9-retron precise parallel editing with homology) 巧妙地将Retron系统与CRIPSR系统结合，通过Retron系统在细胞内逆转录产生单链供体模板DNA, 并且将其与sgRNA共价偶联（专家解读Cell丨实现大规模、高效、精准的基因编辑突变）【9】。在酵母细胞中，将Cas9蛋白、retron逆转录酶及包含供体模板序列的retron ncRNA-sgRNA共表达，单链供体模板DNA可以通过sgRNA和Cas9被特异的募集到Cas9诱导的DSB位点附近。研究发现，这一方法可以高效的完成精确编辑（>80%编辑效率）；并且进一步实验表明该技术可以在酵母细胞中高效精确的敲入长达700bp的DNA序列。但是，Retron系统在哺乳动物细胞是否可以工作还没有研究。

图1 细菌Retron系统的组成及msDNA的产生

近日，辉大生物科技有限公司研发团队和中科院脑科学与智能技术卓越创新中心杨辉课题组合作在Protein & Cell上发表了题为“ Precise Genome Editing without Exogenous Donor DNA via Retron Editing System in Human Cells ”的研究论文。通过对Retron系统的进一步优化，该研究首次证明了Retron系统在哺乳动物细胞中的可适用性，为该工具在高等真核生物细胞中的进一步应用提供重要指导意义。

首先，研究人员通过将四种已被报道具有功能的retron系统 (Ec48、Ec73、Ec86和Ec107) 在哺乳动物细胞内的表达，证明了细菌retron系统能在哺乳动物细胞中逆转录产生单链DNA。进一步，通过将retron RT融合于Cas9蛋白的N端或C端 (RT-Cas9 or Cas9-RT)，以及将retron ncRNA连接于sgRNA的5’端或3’端 (5’ rgRNA or 3’ rgRNA)，研究人员发现Cas9-Ec73RT和3’ Ec73 rgRNA的组合能最有效的在哺乳动物细胞内完成精准DNA编辑 (~10%编辑效率)。

图2 Retron Editing工作示意图及其与DNA碱基编辑器、Prime editing的比较

简而言之，该研究为Retron editing在哺乳动物细胞中的应用进行了初步探索。值得一提的是，先前在酵母中开发CRISPEY系统的Hunter Fraser研究组近期也在预印本网站BioRxiv上报道了他们在哺乳动物细胞中运用Retron系统进行精确基因编辑的相关研究【10】，这也验证了Retron Editing用于哺乳动物细胞精准基因编辑的可行性。鉴于当前版本的Retron editing系统存在编辑效率相对较低、由于Cas9的切割作用产生较高水平的indel等问题，后续还有很多策略可用于Retron editing系统的版本更新升级：1、通过宏基因组数据分析挖掘新的可用于开发高效Retron editing的retron系统；2、由蛋白进化改造提高当前retron RT的逆转录酶活性；3、使用Cas9 nickase代替Cas9来消除DSB造成的不良副产物【11】。

相较于目前比较常用的DNA单碱基编辑及Prime editing【12】，依赖HDR机制的Retron editing相对受到PAM位置限制比较小；并且，Retron editing系统不需要额外提供外源供体模板DNA。另外，目前在植物细胞中由于HDR效率低及外源同源重组供体模板DNA递送困难等原因造成基因 (尤其是长片段) 敲入的效率较低【13】，不需要提供外源供体模板DNA的Retron editing系统也许能为植物基因组编辑提供一个新的选择。因此，Retron editing应用于基因组编辑有其特有的优势，值得后续更多的优化升级工作，以期早日将Retron editing系统应用于临床疾病治疗及作物性状改良等领域。

该研究由辉大生物科技有限公司研发部孔祥锋博士和脑智卓越中心汪子康博士、张仁霞博士研究生等在杨辉博士的指导下完成。辉大生物科技有限公司研发部施霖宇博士、王兴博士和脑智卓越中心周英思博士对该研究做出了重要贡献。

原文链接：

https://doi.org/10.1007/s13238-021-00862-7

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