【关注】让实时荧光定量PCR技术为您的科研助力

定量PCR已经从基于凝胶的低通量分析发展到高通量的荧光分析技术，即实时定量PCR。实时定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离。目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。青海大学附属医院中心实验室瑞士罗氏公司的实时荧光定量PCR仪（LightCycler 480Ⅱ）已开放预约，LightCycler 480Ⅱ仪器配有一个温控模块单元，可容纳 96 孔，五个激发滤光片和六个发射滤光片随意组合能使荧光基团得到最佳激发，并且荧光基团发射的信号能得到精确地测量。

二、应用范围：

荧光定量PCR主要应用在定量和基因分型，定量又包括绝对定量和相对定量。

1.绝对定量分析中目的基因的浓度表达为绝对浓度，例如拷贝数，微克或微摩尔，通过与已知浓度的标准品对比，而拿到未知样品的浓度，常用领域包括细菌、病毒的研究。

2.相对定量通常用于基因表达的研究，绝对的浓度并不重要，通常以目的基因与参比基因的相对浓度比值来表达结果，也可以引入校准样品，来对结果进行归一化的处理，结果也可以选择性的进行PCR效率校正，使其更加精确。相对定量中还经常引入校准品的概念，也就是使用校准品对最终结果进行归一化的处理，未知样本的相对浓度除以较正样本的相对浓度即是归一化的相对浓度，这对不同批次的实验提供了一个稳定的较正点，从而使实验人员能够对不同时间、不同批次的多次实验结果进行校正。

3.基因分型包括终点法和熔解曲线法。对于已知突变位点的基因分型，使用水解探针做终点检测，也可以使用杂交探针或简单探针法熔解曲线的分析，对于新突变位点的筛选，比如SNP、缺失或者插入，相对于目标基因的特定区域，则使用饱和荧光染料对扩增子进行高分辨率熔解曲线分析。

终点法基因分型使用两条序列特异性的探针，一条针对野生型、一条针对突变型，用不同的荧光基团标记。通过对扩增反应终止时的荧光信号检测来判断基因型。

基于熔解曲线的序列分析主要有3种，一种是通过SYBR Green I来进行产物特异性的鉴定，二是使用饱和染料来做高分辨率扫描，三是荧光标记杂交探针来做基因分型。

4.高分辨熔解曲线分析技术（High Resolution Melting）简称HRM，是近年来在国内外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的较新的遗传学分析方法。它是一种高效稳健的 PCR 技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在 PCR 结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、基因分型等分析。

三、实验结果示例

1.DNA或RNA的绝对定量分析：包括病原微生物或病毒含量的检测，转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi 基因失活率的检测等。

2.基因表达差异分析，比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等 )，特定基因在不同时相的表达差异。

3.终点法基因分型的原理是2条水解探针，分别特异性地识别、结合野生型和突变性目标DNA区域，并用不同染料标记。例如SNP检测，甲基化检测等。

4.HRM的主要原理是根据DNA序列的长度、GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析。它是对传统熔解曲线分析的延伸，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。

详细情况，欢迎咨询中心实验室，联系人：田美媛，电话：0971-5512183/0971-5512751