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基于pDS132的基因敲除中创伤弧菌氯霉素的耐药性变化及影响
凤梓涵 王静 金虹 辛文文 康琳 王菁 高姗 李岩伟 袁媛 王景林
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创伤弧菌在海洋环境中较为常见,可以感染鱼类或使人类致病,vvhA基因编码的溶细胞素和rtxA基因编码的重复序列毒素是创伤弧菌的2个重要毒力因子,利用多基因敲除来探究创伤弧菌的vvhA和rtxA1基因在致病过程中的功能至关重要。本研究基于自杀载体构建了创伤弧菌rtxA1和vvhA双基因敲除株,通过实验发现基于自杀载体基因敲除中创伤弧菌氯霉素的耐药性升高,可能影响后续单交换重组的筛选,该结果为基于自杀载体的同源重组技术应用于多基因敲除提供了参考。
摘要
【背景】基于自杀载体的基因敲除在单基因敲除上的应用较为常见,但在多基因敲除过程中细菌耐药性的变化及对后续敲除的影响尚未明确。
【目的】探究基于自杀载体pDS132的创伤弧菌vvhA与rtxA1双基因敲除株构建过程中,创伤弧菌对氯霉素耐药性的变化及对后续基因敲除的影响。
【方法】基于自杀载体pDS132的同源重组法构建创伤弧菌YJ016的单基因敲除株YJ016-ΔvvhA、YJ016-ΔrtxA1和双基因敲除株YJ016-ΔvvhAΔrtxA1,记录单交换筛选时的氯霉素浓度与筛选平板上成功重组的菌株所占比例。琼脂稀释法测定野生型与敲除株的氯霉素最低抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)和抗性突变频率,纸片扩散法测定菌株对其他药物的敏感性,分析其对单交换筛选的影响。
【结果】单基因敲除株的氯霉素MIC及氯霉素抗性突变频率高于野生型;双基因敲除株的庆大霉素抑菌圈直径小于野生型。单基因敲除时,单交换重组菌株的占比为100% (20/20);在YJ016-ΔvvhA上敲除rtxA1基因,氯霉素筛选浓度为2、4 μg/mL时,单交换重组菌株的占比分别为40% (8/20)、5% (1/20);在YJ016-ΔrtxA1上敲除vvhA基因,氯霉素筛选浓度为2、4 μg/mL时,单交换重组菌株的占比均为0% (0/20)。
【结论】基于自杀载体pDS132的基因敲除中创伤弧菌氯霉素的耐药性升高,可能影响后续单交换重组的筛选,该结果为基于自杀载体的同源重组技术应用于多基因敲除提供了参考。
图1 单基因敲除株(A)与双基因敲除株(B)的构建过程
Figure 1 Construction of single (A) and double (B) gene knockout strains
图2 敲除株的PCR鉴定
Figure 2 Identification of gene knockout strains by PCR
图3 YJ016-ΔvvhA与pDS132-rtxA1单交换重组菌株的sacB-vvhA双重PCR鉴定
Figure 3 Identification of YJ016-ΔvvhA single-crossover recombined with pDS132-rtxA1 by diplex PCR
图4 各菌株cat基因的PCR检测
Figure 4 Detection of cat gene by PCR for each strain
图5 各菌株的生长曲线
Figure 5 Growth curve of each strain
图6 菌株在不同浓度氯霉素下的突变频率
Figure 6 The mutation frequency of strains under different concentrations of chloramphenicol
图7 其他抗生素的药敏试验结果
Figure 7 Results of susceptibility test of other antibiotics
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微生物学通报
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本期制作:赵彬涵
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