细菌自然转化中外来DNA整合的新模型

来源：BioArt

撰文 | 雪月

责编 | 兮

分子克隆实验中重要的一步是细菌的人工转化。自然状态下细菌也会发生转化，从外界环境中获得遗传物质，在特定的生理状态下，从外界吸收的DNA整合重组到生物体自身的基因组中，导致自然转化(natural transformation NT)。自然转化是原核生物横向基因转化(horizontal gene transfer HGT)的主要方式。其他HGT方式包括：结合(conjugation)，通过专门的结合菌毛将DNA从细胞转移到另外细胞；噬菌体转导(phage transduction)，即病毒介导的DNA转移。HGT在细菌进化中起到主导作用，它是病原体获得致病能力以及传播毒力因子的主要途径【1】。当下多重耐药菌数量激增，传播范围扩大，关于HGT的研究显得更为重要。 

早在1928年Frederick Griffith在研究肺炎球菌致病特征交换时发现了自然转化。然而NT这一过程中许多基础性问题还未得到阐明。NT发生时，细胞与dsDNA接触，其中的一条链会进入细胞浆中。ssDNA 会与重组蛋白组成ssDNA-RecA复合物，RecA蛋白促进ssDNA进行同源搜索以及入侵细菌基因组，从而形成三链D环中间体。D环中的分支会发生迁移进行延伸。之后有假说提出延伸后的DNA链通过未知的机制将整合的转化DNA（transform DNA，tDNA）和基因组之间形成稳定的异源双链体。异源双链体接下来会进入到错配修复或者染色体复制与分离等过程中。目前tDNA转化这一过程中的多个环节的还缺乏直接的证据，处于假说的状态。 

2019年12月12日，美国印第安纳大学Triana N. Dalia课题组在Cell上发表了题为“Spatiotemporal Analysis of DNA Integration during Natural Transformation Reveals a Mode of Nongenetic Inheritance in Bacteria”的文章。该研究开发出一种细胞生物学标志物的方法来探究霍乱弧菌在自然转化过程中同源重组的时间和空间动态变化的机制。研究发现：tDNA以单链的形式整合到基因组；产生的异源双链体通过染色体复制和分离得以稳定存在；整合的tDNA会在细胞分裂之前迅速表达。

该课题组先前的研究发现ComM是霍乱弧菌发生NT时促进分支迁移的六聚体解旋酶【2】。纯化的ComM在ATP和ssDNA存在的情况下形成六聚体。作者假设在发生tDNA整合入基因组时ComM在整合位点形成具有活性的多聚体复合物。于是作者只做了一个荧光融合的ComM蛋白，表达在一株转化频率高达50%的组成型感受态霍乱弧菌。在没有tDNA时，GFP-ComM弥散分布在细胞浆中。在tDNA出现时，ComM蛋白会形成荧光聚点。为了验证这一猜想，作者利用ParB/pasS系统来标记霍乱弧菌基因组：利用荧光融合蛋白标记ParB（yGFP-ParB1和CFP-ParB2），融合蛋白可以特异性的分别结合到基因组parS（parS1和parS2）位点。parS1位点是靠近基因组终点的位置，而parS2位点时靠近基因组起点的位置。作者结合两个系统验证了猜想，分别用能够整合到靠近parS1或parS2位点的tDNA诱导NT，ComM荧光聚点分别会和pasS1或parS2共定位。这个系统实现了在单细胞水平追踪tDNA整合入基因组。 

利用这个追踪系统作者为自己的猜想提供了直接和定量的证据。作者利用组成性表达yGFP-ParB1 / CFP-ParB2并包含单个parS2位点的霍乱弧菌细胞做实验。然后，用能代替parS2位点转换为parS1位点的tDNA转化入这些细胞。如果tDNA是通过ssDNA的形式整合到基因组，则会得到两个不同的子代，分别含有parS2和parS1。实验发现约有94%的表型是符合ssDNA整合方式假说的，整合后的异源双链体通过染色体复制分离得以稳定存在。余下6%的dsDNA整合可能是因为多个tDNA被摄取和整合的结果。作者对转化过程多个时间点观察发现，ComM聚点形成后parS2位点的很快丢失表明tDNA整合在ComM聚点形成后迅速发生。作者接下来构建了一株表达mCherryParB1 / CFP-ParB2，基因组parS1和parS2位点紧邻的菌株，其中parS1位点替代了GFP基因的启动子和5'端。用tDNA转化细胞会删除parS1位点，恢复GFP基因和启动子，导致GFP基因表达。这个系统用来研究tDNA整合后的表达时间。研究发现整合后的tDNA表达发生在基因组复制之后，细胞分裂之前。分裂之后有一个子代细胞继承了tDNA衍生的非遗传性蛋白产物。tDNA衍生产物虽然不能遗产下去，但在抗生素耐药基因存在的情况下，衍生物则能发挥保护转化细胞的作用。作者将带有卡那霉素抗性的tDNA转入标记有CmR细胞，KanR会代替CmR。转化后发现子代会携带两种抗性产物。但是带有CmR的后代不能继续产生卡那抗性，延长实验观察时间，这种非遗传性物质获得的抗性持续了11代。 

综上，作者利用直接的证据证明了tDNA转化的模型：ssDNA整合通过复制而分离异源双链体，导致有一半子代未继承到遗传物质，另一半子代只得到了非遗传性衍生物。这样的模式会让一半的子代短期内获得潜在的益处，而不必承担整合导致的有害突变或者降低其长期适应能力的风险

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.11.021

制版人：小娴子

参考文献

1. Blokesch M.Natural competence for transformation. Currentbiology : CB 2016; 26(23): 3255;doi 10.1016/j.cub.2016.11.023.

2. Nero TM, Dalia TN, Wang JC, Kysela DT, Bochman ML, DaliaAB. ComM is a hexameric helicase that promotes branch migration during naturaltransformation in diverse Gram-negative species. Nucleic acids research 2018; 46(12):6099-6111; doi 10.1093/nar/gky343.