【综述】中性粒细胞在肾癌发生发展中的作用及其研究现状

肾细胞癌是泌尿系统常见的肿瘤之一，约占成人恶性肿瘤的3%，2018年全球肾癌病死率和发病率分别占所有癌症病例的1.8%和2.2%^[1]。对于晚期肾癌患者，占主导地位的全身系统治疗经历了细胞因子时代、靶向治疗时代，近年来以免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitor，ICI）为代表的免疫治疗在晚期肾癌患者中显示出可观的疗效，开启了晚期肾癌免疫联合靶向或免疫联合免疫治疗的新时代，但免疫微环境在影响肾癌进展中的作用及其影响机制仍在探索中。肿瘤相关的炎症在肿瘤的发生、发展、侵袭、转移、治疗应答等方面均起到重要作用，并且与血管生成、细胞因子失调等机制相关。中性粒细胞在肿瘤微环境中的浸润已经被证实与多种肿瘤的不良预后相关^[2]。近年来，中性粒细胞在肾癌的发生、发展过程中的价值受到重点关注，国际转移性肾细胞癌联合数据库（International Metastatic Renal Cell Carcinoma Database Consortium，IMDC）曾提出一项对转移性肾癌患者进行预后危险度分组的评分系统，可多因素评价接受靶向药物治疗肾癌患者的预后，中性粒细胞计数是其预测因素之一^[3]。外周血中性粒细胞-淋巴细胞比值（neutrophil-lymphocyte ratio，NLR）已被证明可作为预测肾癌不良预后的独立危险因素^[4]。本文就中性粒细胞、相关趋化因子及胞外诱捕网在肾癌中的作用机制，以及其预测肾癌患者预后、评价全身系统治疗疗效的研究进展进行综述。

一、中性粒细胞与肿瘤的相互作用

中性粒细胞作为人体免疫系统中免疫细胞的重要构成之一，其大量募集和激活可介导抗肿瘤免疫应答早已成为共识。中性粒细胞依据梯度密度不同，被分为3个亚群：低密度中性粒细胞（low-density neutrophil，LDN）、正常密度中性粒细胞（normal-density neutrophil，NDN）和高密度中性粒细胞（high-density neutrophil，HDN）。在肿瘤微环境中，LDN主要发挥T细胞抑制功能，其前体被称为髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）^[5]。MDSC分为多形核MDSC（PMN-MDSC）和单核MDSC（M-MDSC）。二者都是不成熟的髓系来源的细胞，并且具有免疫抑制功能。PMN-MDSC的表型和形态均与中性粒细胞有相似之处，如分子标志物均为CD11b+CD14-CD15+/CD66b+，但生物学功能却不尽相同。PMN-MDSC与中性粒细胞最大的差异在于其免疫抑制活性，PMN-MDSC除直接抑制T细胞功能外，还可抑制其他骨髓细胞和自然杀伤细胞的活性和功能^[6]。相比之下，中性粒细胞通常参与其他髓细胞和淋巴细胞的激活、调节和效应功能。此外，凝集素型氧化LDL受体-1（LOX-1）在PMN-MDSC上高表达，可区分MDSC与中性粒细胞^[7]。

肿瘤相关中性粒细胞（tumor-associated neutrophil，TAN）由MDSC分化而来，可分为2个细胞亚型：具有促炎症、抗肿瘤作用的N1表型；具有抑制免疫反应、促肿瘤作用的N2表型。N1表型对肿瘤生长和转移的抑制作用是通过直接性或抗体依赖性细胞毒性，以及通过激活不同的免疫细胞来发挥的。相反，N2表型通过分泌细胞外基质重塑酶和促血管生成因子来推动肿瘤转移和血管生成，导致肿瘤生长以及肿瘤细胞扩散。体外实验中，TAN在肿瘤生长因子（tumor growth factor，TGF）-β等因素的驱动下，中性粒细胞可转化为N2表型，反之将TGF-β阻断后可转化为N1表型^[8]。肿瘤患者体内的中性粒细胞可以表现为促进肿瘤或抑制肿瘤作用，这两种不同类型的行为受到肿瘤微环境内癌细胞或纤维基质细胞发出的信号调控。N2表型中性粒细胞可分泌脂蛋白-2，诱导肿瘤细胞发生间质上皮转化，促进肿瘤侵袭、转移，并且这一现象与信号传导及转录激活蛋白-3的表达上调显著相关^[9]。总之，在其他免疫细胞及细胞因子的影响下，中性粒细胞在肿瘤患者中的保护作用被抑制，而危害因素即促瘤作用被放大。同时，肿瘤细胞通过分泌促炎因子，诱导血管内皮细胞分泌活化分子和白细胞黏附分子，增加对中性粒细胞的招募作用。肿瘤微环境中的IL-1和肿瘤坏死因子-α能够介导肿瘤血管细胞黏附分子的表达，这些血管内皮细胞与细胞因子的相互作用产生的分子可使中性粒细胞离开血液、穿过血管内皮进入肿瘤微环境^[10]。

中性粒细胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）是由中性粒细胞胞质与颗粒蛋白在胞外组成的以DNA为骨架的大型网状结构，通过诱捕等途径消灭病原体，是中性粒细胞发挥作用的主要方式之一。NETs形成机制主要有两种，包括细胞裂解型与细胞非裂解型。裂解型NETs形成初期会使肌动蛋白停滞以及细胞去极化^[11]。随后细胞核包膜解体，核染色质解聚进入细胞质，并与细胞质和颗粒成分混合。在中性粒细胞活化3～8 h后发生质膜通透，进而使NETs扩展至细胞外。研究结果表明，中性粒细胞通过细胞表面分子CD11b直接相互作用或释放NETs来捕获循环中的肿瘤细胞，将其包裹、隔离，并促进远处器官的黏附^[12]。研究结果显示，在小鼠模型中，肝脏内中性粒细胞产生的NETs吸引和包围癌细胞，加速形成远处转移^[13]。除此之外，恶性肿瘤也能够促进NETs形成，并且导致与NETs相关的并发症。在构建的晚期乳腺癌动物模型中，NETs与肺静脉血栓同时发生^[14]。NETs向外周血中释放的染色质，有促凝血和促血栓的作用，导致凝血功能异常和肿瘤血栓相关事件。小鼠中性粒细胞在粒细胞集落刺激因子和脂多糖的共同刺激下形成NETs，同时可观察到血小板减少和微血栓形成，均提示癌前的凝血功能异常状态^[14]。

二、中性粒细胞在肾癌中的作用机制

1.炎症、趋化因子与肾癌：针对转移性肾癌，细胞因子治疗及目前应用的ICI都具有一定疗效，且后者疗效良好，说明炎症及免疫应答是晚期肾癌治疗中的重要环节之一。既往研究结果表明，肿瘤组织内的炎症相关基因表达、中性粒细胞浸润与肿瘤大小、低血红蛋白存在相关性，并且可作为局限性肾癌的生存预后标志^[15]，但其机制仍不十分明确。NLR作为反映全身性炎症的标志物之一，其术前水平升高在局限性肾癌患者中与肿瘤侵犯假包膜、总体生存期（overall survival，OS）缩短相关。近年来，对于局限性肾癌患者，保留肾单位手术（nephron-sparing surgery，NSS）是被指南推荐的主要手术方案，尤其是T1期肾癌。标准肾部分切除术与肾肿瘤剜除术均可作为NSS的可选手术方式，虽然其疗效尚存在争议，但肿瘤假包膜作为肾肿瘤剜除术的前提，无假包膜的肿瘤更容易导致术后切缘阳性、肿瘤局部复发^[16]。通过术前NLR水平可在一定程度上预测肿瘤假包膜侵犯，从而对拟行NSS的局限性肾癌患者制订合理的手术方案^[17]。最近一项研究结果显示，中性粒细胞在肿瘤微环境中浸润是肾癌及其肺转移灶进展的重要因素之一，并且与原发灶血管生成相关，导致肾癌原发灶与转移灶的生长^[18]。肾癌相关炎症可改变中性粒细胞表型，可观察到CXCL1、CXCL2、CXCL5、CXCL8等4种CXC趋化因子上调。CXC趋化因子高表达与肾癌患者的不良预后相关^[19]。而具有促血管生成、促炎症反应作用的趋化因子CXCL7，也被证明是导致肾癌不良预后的因素^[19]。IL-1β可诱导肾癌组织CXCL7的过表达，进而导致肿瘤细胞增殖、促进肿瘤生长，而阻断CXCL的受体（CXCR1、CXCR2）能够抑制肾癌内皮细胞增生与血管生成，达到减缓肿瘤进展的目的。一项生物信息学分析研究结果指出，在肾癌微环境中，趋化因子CXCL2/3/5/9/10/11/12/13/16的表达与中性粒细胞呈正相关，其中CXCL1/5/9/10/11/13与肾癌患者病理分期存在相关性，而CXCL1/2/3/5/13的低转录水平预示着更优的预后结局^[20]。既往学者认为肾癌并非是一种性激素依赖的恶性肿瘤，但肾癌在男女之间的发病率仍有区别。一项机制研究结果表明，中性粒细胞浸润通过上调肾癌细胞中雄激素受体-cMyc信号通路传导来增强肿瘤细胞增殖^[21]，该结果可能也是男性肾癌发病率高于女性（男性∶女性约为1.7∶1^[1]）的机制之一。

2. NETs与肾癌发生发展的关系：中性粒细胞在清除病原体的过程中发挥重要作用，但特定情况下其亦会损伤机体组织，因此中性粒细胞发挥作用受到3种机制的严格调控：吞噬、脱颗粒和NETs。近年来，关于中性粒细胞影响肿瘤的机制研究愈发成为热点，多数学者倾向于认为是多种机制的共同作用，体内活跃的NETs状态可能导致肿瘤的进展风险增加。NETs在肿瘤转移灶中状态活跃，并且血清NETs水平可以在一定程度上早期预测肿瘤转移的发生^[13]。同时，NETs释放的DNA成分可成为吸引癌细胞的趋化因子，而不仅仅是癌细胞的“诱捕陷阱”。NETs作为中性粒细胞发挥免疫作用的重要途径之一，已可以在肾癌患者的外周血中检出，循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）计数与NETs 产生的关键分子的表达如MPO、ELANE、MMP9、PAD4、CTSG、HMGB2等呈正相关^[22]。NETs形成的DNA骨架与纤维蛋白网能够捕获肾癌CTC，以协助其逃过免疫系统的攻击并存活，通过NETs相关分子表达建立的评分亦是肾癌患者的独立预后因素^[22]。

三、中性粒细胞对肾癌治疗疗效和对预后的预测价值

对于转移性肾癌患者而言，以血管内皮生长因子-酪氨酸激酶抑制剂（vascular endothelial growth factor-tyrosine kinase inhibitor，VEGF-TKI）为代表的靶向药物、ICI为代表的免疫治疗药物均可有效改善其生存结局^[23]。Ko等^[3]的研究结果显示，在接受二线靶向药物治疗的转移性肾癌患者中，外周血中性粒细胞计数高于正常值上限是导致OS下降的因素之一。

1.与靶向药物治疗的相关性：在接受靶向药物治疗的转移性肾癌患者中，基线NLR较高的患者其无进展生存期（progression free survival，PFS）、OS均较短，但治疗开始后出现NLR下降提示其生存预后的改善^[24]。中性粒细胞产生的趋化因子CXCL7也被证明是舒尼替尼一线治疗转移性肾癌有效性的预测标志物。通过测定采用尼替尼治疗患者的血浆CXCL7，基线水平＞250 ng/ml者显示出更优的PFS（HR=0.32，95%CI 0.15～0.71，P=0.001）^[25]。然而，该研究中血浆CXCL7水平的意义与既往研究结果恰好相反，即肿瘤组织CXCL7表达是促进肾癌发展的危险因素^[19]。其可能的机制是在肾癌发展的初始阶段，免疫细胞通过分泌CXCL7来介导抗肿瘤免疫应答，导致其血浆水平改变。随后，产生CXCL7的肿瘤细胞通过吸引中性粒细胞、促进内皮细胞增生等途径（中性粒细胞和内皮细胞均表达CXCL7受体），局部发生免疫耐受、炎症反应、血管生成，最终导致CXCL7水平在肿瘤中升高，而在血浆中降低^[25]。

2.与免疫治疗的相关性：在以ICI作为一线或二线治疗转移性肾癌患者的研究中亦有相似的结果^[26]，基线NLR较高和治疗开始后6周NLR较高患者具有客观缓解率（objective response rate，ORR）降低、PFS缩短、OS缩短的趋势。一项研究采用纳武单抗治疗90例转移性肾癌患者，基线NLR≥4.2是患者PFS缩短的危险因素（HR=1.86，95%CI 1.05～3.29，P=0.033）^[27]。NLR是中性粒细胞绝对计数和淋巴细胞绝对计数的比值，实质上反映了肿瘤炎症与人体抗肿瘤反应之间的平衡。外周血中性粒细胞计数升高是慢性炎症的标志，可导致癌症患者免疫力下降、肿瘤生长和转移以及不良预后。

四、小结

中性粒细胞作为人体中最多、具有重要意义的免疫细胞之一，其在肿瘤患者体内可以表现为抑癌或促癌作用。在肿瘤免疫微环境中，中性粒细胞浸润是肾癌原发灶与转移灶发展的推动因素，通过表达趋化因子促进血管生成、介导炎症反应，与患者不良预后结局存在相关性。NETs是中性粒细胞清除病原体的一种作用方式，但其产生的NET-DNA可能成为肾癌CTC的庇护所，与CTC共同包裹为团块并发生远处转移。对于接受系统治疗（以VEGF-TKI、ICI为主的一线、二线治疗）的转移性肾癌患者而言，肿瘤组织中性粒细胞浸润、外周血中性粒细胞计数增高、NLR增高均提示治疗有效性下降、预后变差，而冶疗过程中NLR下降提示预后结局改善。总而言之，中性粒细胞在肾癌中导致肿瘤进展的推动作用应当引起重视，其作为潜在治疗靶点的可能性仍需进一步探讨。