基因治疗的革命性研究成果，将AAV进行定向进化，有望将“药物”递送到任何组织

替换或编辑致病突变为治疗许多人类疾病带来了巨大希望。然而，在体内向特定细胞递送治疗性遗传修饰剂一直具有挑战性，尤其是在解剖学上分布的大型组织（如骨骼肌）中。

2021年9月9日，博德研究所Mohammadsharif Tabebordbar等人在Cell 在线发表题为“Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species”的研究论文，该研究建立了一种体内策略来进化和严格选择腺相关病毒 (AAV) 的衣壳变体，这些变体能够有效地递送到所需的组织。使用这种方法，该研究确定了一类含有 RGD 基序的衣壳，其在小鼠和非人类灵长类动物中静脉注射后以优异的效率和选择性递送到肌肉。在两种遗传性肌肉疾病小鼠模型中，证明了与天然存在的 AAV 衣壳相比，这些工程载体的效力和治疗功效显著增强。该研究的选择方法中的最优衣壳变体显示出在各种近交小鼠品系以及食蟹猴和人类原代肌管中递送的保守效力，递送依赖于靶细胞表达的整合素异二聚体。

总之，该研究报告了跨物种的高效肌肉定向 AAV 衣壳变体家族的进化、工程和机制表征。 该研究在多个遗传性肌肉疾病小鼠模型中证明了这些载体的治疗功效，即使在低剂量下也是如此。这些载体有可能促进针对大量肌肉骨骼疾病的肌肉定向治疗基因递送。更广泛地说，此处描述的 DELIVER 系统提供了一个高度适应性的平台，用于识别体内任何组织或细胞类型的精确 AAV 衣壳变体，这可以极大地扩展该载体系统跨领域和学科的临床和实验应用。研究人员预计，在其他组织和器官系统中采用 DELIVER 将在加速基因治疗和其他基因组医学方法的开发和转化方面产生深远的影响，以治疗各种人类疾病。

截至发稿前，基因编辑领域的前沿公司CRISPR Therapeutics，Editas Medicine等大涨。

重组腺相关病毒 (rAAV) 是临床前和临床研究中最常用于体内基因替代治疗和基因编辑的载体，但全身递送后特定组织的选择性递送仍然是一个挑战。使用天然衣壳产生的重组 AAV 在全身注射后主要隔离在肝脏中。这种隔离限制了其他器官的递送效率，并对向骨骼肌传递基因提出了特殊挑战。由于肌肉占全身质量的 40%，在具有天然衣壳变体的肌肉中达到治疗阈值需要极高的病毒剂量 (~2E+14 vg/kg)，这为载体制造和正如在最近的一些临床试验中所观察到的那样，可能导致治疗限制性毒性。

AAV 衣壳蛋白工程与体内选择相结合是一种有前途的方法，可以将有效和选择性的基因传递到各种组织。AAV 衣壳导向的进化策略通常涉及生成不同的衣壳文库，然后在细胞培养和/或动物模型中选择具有所需向性的变体。这种方法产生了改进的载体，用于增强向许多组织的递送。

文章模式图（图源自Cell ）

为了取得最大成功，定向进化方法必须能够在 mRNA 水平上严格选择不同菌株和物种的功能性衣壳变体。AAV 递送是一个多步骤过程，包括与细胞表面受体结合、细胞内运输、内体逃逸、核进入、载体基因组第二链 DNA 合成和转基因表达，并且这些步骤中的任何一个的低效率都会限制载体效力。因此，成功鉴定有效的衣壳需要选择在递送的所有阶段都能有效进行的变体。

然而，大多数体内衣壳定向进化策略是根据载体基因组 DNA 而非转基因 mRNA 在感兴趣组织中的存在来选择成功的衣壳变体。涉及 AAV 递送的基因的编码序列和表达的物种和菌株特异性差异提出了另一个挑战，因为在特定小鼠菌株中选择的衣壳变体可能不会在其他菌株或其他物种中产生有效的递送。

在这里，该研究开发了 DELIVER（利用转基因 RNA 体内表达的 AAV 衣壳定向进化）策略，将不同衣壳文库的生成与严格的基于转录本的体内选择相结合，并实现定向进化，然后识别任何组织中的功能性衣壳变体。该研究应用 DELIVER 在小鼠和非人类灵长类动物 (NHP) 中开发肌肉嗜性衣壳，并将该研究的结果与 AAV9 和 AAVrh74 进行比较，这两者都是目前用于杜氏肌营养不良症 (DMD) 基因替代试验的天然 AAV 衣壳。总体而言，与 AAV9 和 AAVrh74 相比，该研究的肌肉导向载体在骨骼肌和心脏组织的递送方面表现出卓越的效力和选择性。这些载体进一步证明了跨小鼠、NHP 和人类肌肉细胞的保守递送效力。

小鼠和 NHP 中富含肌肉的变异衣壳序列的交叉比较确定了变异中常见的精氨酸 - 甘氨酸 - 天冬氨酸（RGD）基序。总之，这项工作提供了一类 AAV 衣壳变体，特别适用于横纹肌的治疗开发和测试。它还提供了一个全面的实验框架，用于未来具有替代组织嗜性的其他 AAV 家族的进化。研究人员预计，在其他组织和器官系统中采用 DELIVER 将在加速基因治疗和其他基因组医学方法的开发和转化方面产生深远的影响，以治疗各种人类疾病。

来源：iNature