Science | 张锋团队再发文，开拓新型基因编辑工具
责编 | 酶美
CRISPR-Cas9（II型CRISPR-Cas）作为存在于大多数细菌与所有的古菌中的一种可以识别和摧毁入侵病原体的免疫防御系统，已被用于真核细胞的基因组编辑【1】。IscB蛋白是由IS200/IS605转座子超家族一个独特子集编码的推定核酸酶，被认为可能是Cas9的祖先【2】，这个家族还包含编码tnpB的转座子，也是一种推定的核酸内切酶，被认为是V型CRISPR效应子Cas12的祖先【3】。尽管IscB蛋白在原核生物中广泛分布，并与Cas9共享结构域组成（图1），但其功能还是未知的。此外，截至目前，尚未有研究报道IscB与非编码RNA （non-coding RNA, ncRNA）或CRISPR阵列相关，因而Cas9系统的进化起源还不能确定。
2021年9月9日，来自美国MIT的张锋团队在Science杂志上发表了一篇题为 The widespread IS200/605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases 的文章，该团队利用系统发育分析、RNA-seq和相关生化实验，重建了CRISPR-Cas9系统的进化起源。此外，该研究还表明IscB蛋白利用单个ncRNA进行RNA引导的双链DNA切割，并可用于人类细胞的基因组编辑，同时，先前推定的另一核酸酶TnpB也同样具备RNA引导的核酸酶活性。总的来说，这项工作揭示了一类广泛的转座子编码的RNA引导核酸酶，并将其命名为“OMEGA（Obligate Mobile Element Guided Activity）”，对于推动生物技术的发展具有重要意义。
IscB包含与Cas9共享的BH、HNH和间隔的RuvC结构域（图1），该团队对包含HNH或RuvC的蛋白进行全面检索，发现仅Cas9和IscB这两种蛋白同时包含这两个结构域，系统发育分析也强烈表明所有现存的Cas9s均来自单个祖先IscB。此外，该团队确定了31个独特的CRISPR相关iscB基因座，在大肠杆菌中异源表达并纯化其中一个CRISPR相关iscB基因座并对共纯化的RNA进行测序，证明IscB蛋白可以与单个ncRNA成分相互作用。重组RNA复合物的体外切割实验进一步证实了IscB具备RNA引导的靶向dsDNA的核酸酶活性。
图1. IscB和Cas9结构域组成比较
继续对iscB基因座ORF的上下游保守核苷酸序列进行检索发现，其上游存在一段高度保守序列，二级结构预测显示多个G:U配对的存在，提示该保守区编码包含重要发夹结构的ncRNA（ωRNA），而ωRNA中5’端最不保守的序列被认为可能发挥引导序列的作用（图2）。为了验证这一推断，该团队体外质粒切割实验确认KralscB-1以ωRNA依赖性方式切割靶标，且更换不同引导序列也会导致新的靶向切割，这意味着IscB是一种可重编程的RNA引导的核酸酶。
图2. 对ωRNA的二级结构预测
除了IscB，该团队发现了一个IS200/605超家族转座子中编码的不含HNH结构域的同源蛋白，命名为IsrB，以及一组更小的缺乏RuvC结构域的蛋白家族IshB。为了研究这些蛋白质之间的进化关系，该团队通过最大似然法构建系统发育树分析IscB、IsrB和Cas9的进化事件，进一步支持IscB的“祖先”身份。Ignatius tetrasporus UTEX B 2012，一种陆生绿藻的叶绿体基因组中也鉴定出多个iscB基因座，提示这种真核IscB也同样具有DNA切割活性。
通过深入分析大型IscBs的进化枝，该团队还筛选出6种大型IscB蛋白，以了解它们在真核细胞内（HEK293FT）染色质结构复杂环境中的基因组编辑效率。其中，OgeulscB协同16 nt guide可以实现最大的插入/缺失率，因而有望成为基于IscB的基因组编辑工具的候选者。此外，在前面已经提到，除了IscB之外，IS200/IS605超家族转座子还编码另一个被认为是Cas12s祖先的TnpB蛋白，在这项研究中，作者也通过从大孢囊脂环菌 (AmaTnpB) 中重组纯化了 TnpB来验证其dsDNA核酸内切酶活性（图3）。
图3. Ω系统与其他已知RNA引导的DNA靶向系统的比较（CRISPR系统通过捕获间隔序列并储存在CRISPR阵列基因座中，与CRISPR系统不同，Ω系统可以将它们的基因座转置到靶标序列中，将靶标转化为ωRNA guides）。
总的来说，这项研究通过对Cas9进化的探索，发现3种高度丰富但先前未作表征的转座子编码的可编程RNA引导核酸酶：IscB、IsrB和TnpB，鉴于移动原件的定位和移动可能决定其引导序列特性，因而将其命名为Ω（OMEGA：Obligate Mobile Element Guided Activity)（图3），这一系统的生物学功能仍有待探索。这些发现可能代表了大量还未开发的各种RNA引导机制，不仅存在于原核生物中，而且存在于真核生物中（本研究对叶绿体基因组IscB的鉴定），强调了RNA引导系统不仅在功能上丰富多样，同时还渗透到生命的各个领域。
参考文献
1. F. Zhang, Development of CRISPR-Cas systems for genome editing and beyond. Q. Rev. Biophys. 52, e6 (2019). doi:10.1017/S0033583519000052
2. V. V. Kapitonov, K. S. Makarova, E. V. Koonin, ISC, a novel group of bacterial and Archaeal DNA transposons that encode Cas9 homologs.J. Bacteriol. 198, 797- 807 (2015). doi:10.1128/JB.00783-15 Medline
3. P. Siguier, E. Gourbeyre. M. Chandler. Bacterial insertion sequences: Their genomic impact and diversity. FEMS Microbiol. Rev. 38, 865-891 (2014). doi:10.1111/1574-6976.12067 Medline