学科前沿|南京大学生科院李根喜教授课题组在新冠肺炎病毒检测新方法研究方面取得多项成果
新型冠状病毒肺炎疫情，简称新冠肺炎疫情，由严重急性呼吸综合征-冠状病毒2（SARS-CoV-2）感染而引发。疫情出现以后，借助当今先进的生物技术及医学诊断技术，国内外临床检验工作者迅速制定了新冠肺炎病毒检测方案，为有效抗击疫情创造了条件。与其同时，相关领域基础研究的学者纷纷开展了相关研究，以便为新冠肺炎病毒检测方法提供技术支持。
南京大学生命科学学院李根喜教授课题组长期从事生物分子工程及临床检测应用方面的研究工作，在基于生物传感的分子诊断技术研究方面取得了系列研究成果。新冠肺炎疫情出现以后，李根喜教授课题组及时调整研究工作重心，在我校专项资金的支持下，与南京市第二医院（南京市新冠肺炎患者定点收治医院）易永祥院长、检验科李金龙副主任等专家合作，致力于研发基于生物传感技术的低成本、便捷式新冠肺炎病毒检测新方法，并且取得了多项研究成果。
（1）研发了一种基于共价有机框架胶囊可视化检测SARS-CoV-2 RNA的方法。对于新冠肺炎这样的恶性传染性疾病，“床边检测技术”，也就是仅需小型、甚至无需检验设备即可居家进行检测的技术尤为重要。为此，李根喜教授课题组基于共价有机框架胶囊提出了可视化检测SARS-CoV-2 RNA的新方法。共价有机框架（Covalent organic frameworks，COFs）由于其结构和功能的多样性，近年来受到了研究人员的广泛关注，它们独特的理化性质使其在生物传感领域展示出巨大的应用潜力。李根喜教授课题组设计了一种新颖且简便的策略来制备共价有机框架胶囊，并开发了一种新型的比色测定法将该胶囊用于SARS-CoV-2 RNA的可视化检测。他们采用可降解的一种金属有机框架材料（MOFs）ZIF-90作为牺牲模板来制备空心的COF胶囊，用于封装辣根过氧化物酶（HRP），所制备的COF胶囊可为酶分子提供合适的微环境，改善酶的构象自由度，增强传质能力，并赋予酶较高的环境耐受性。值得注意的是，包裹在COF胶囊中的酶具有显著的稳定性和可重复使用性，该方法结合了COFs和MOFs两种纳米材料的优势，为提高酶的性能开创了一种的新途径。通过这种设计，他们所提出的方法对于SARS-CoV-2 RNA的检测表现出卓越的分析性能。如图1所示，检测限低至1.65pM，单碱基错配也可被检出，使用该方法分析临床样本，可以成功区分出新冠肺炎患者与健康人群，显示出广阔的应用前景。这一工作已发表在国际著名学术期刊Chem. Eng. J. (IF: 13.273)，论文链接https://authors.elsevier.com/sd/article/S1385-8947(21)03911-5，我校博士研究生王明慧同学为论文第一作者，李根喜教授、杨洁教授与南京市第二医院检验科李金龙副主任为共同通讯作者。
图1. 该可视化分析方法的检测性能
（2）研制了一种灵敏检测SARS-CoV-2 RNA的电化学生物传感器。电化学生物传感器具有设备简单、操作简便、价格低廉等优势，例如糖尿病人广泛使用的血糖仪就是第一代的电化学生物传感器。目前，新冠肺炎患者筛查主要依赖于实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）。但是，这种诊断手段存在一些技术缺陷如处理时间长、涉及专用仪器，难以克服的假阴性等，因此需要进一步开发更加简便、可靠的诊断系统，以对可疑患者进行全面筛查。电化学生物传感器被认为是最强大的替代工具之一。基于此，李根喜教授课题组通过结合催化发夹自组装（CHA）和末端脱氧核糖基转移酶（TdT）的信号放大功能，构建了一种电化学生物传感器用于SARS-CoV-2 RNA检测。如图2所示，在他们的设计中，SARS-CoV-2 RNA序列的存在可以触发CHA生成双链产物，并伴随SARS-CoV-2 RNA的循环。然后，双链产物将与在电极表面修饰的DNA发夹结构杂交，并形成具有三个突出的3'端的Y形结构DNA，该结构可通过TdT酶进行延伸以形成长的单链DNA产物。因此，在添加Ru(NH3)63+之后，产生了显著增强的信号，用于SARS-CoV-2 RNA的灵敏定量。除了具有信号高和抗干扰能力强的优点外，他们所构建的电化学生物传感器可应用于临床样本中的检测，证明了其巨大临床应用潜力。这一工作发表在国际著名学术期刊Biosensors & Bioelectronics (IF: 10.618)，论文链接https://doi.org/10.1016/j.bios.2021.113309，我校博士研究生彭英同学为论文第一作者，李根喜教授和南京市第二医院易永祥院长为共同通讯作者。
图2. 用于检测SARS-CoV-2 RNA的电化学生物传感器的原理
（3）建立了一种基于检测刺突蛋白的SARS-CoV-2分析方法。新冠肺炎疫情出现以后，结构生物学家很快解析出了新冠病毒颗粒的结构，为新药研发打下了基础，也为病毒检测新方法的建立创造了条件。另一方面，医学检验、尤其是对于经常需要大规模筛查的疫情防控，需要尽可能降低成本。因此，李根喜教授课题组借助核酸适配体功能化纳米通道建立了SARS-CoV-2分析新方法。医学检验往往需要抗体，价格较贵，为此他们与中国科技大学罗昭峰团队合作，由中国科大的同行筛选到与SARS-CoV-2刺突蛋白S1具有高亲和力的核酸适配体，在此基础上，受SARS-CoV-2刺突蛋白与其受体人血管紧张素转换酶II（ACE2）在S1亚基上的一个区域结合的启发，他们通过修饰在阳极氧化铝膜上的适配体结合病毒的刺突蛋白引起空间位阻及电性的变化从而改变离子电流，进而实现了对S1蛋白的生物传感。该方法无需酶和其他试剂的加入，灵敏度高且费用低廉，对SARS-CoV-2 S1蛋白的检测限为1fM，用于临床咽拭子标本中病毒颗粒的检测，效果明显，有潜力被开发为诊断新冠肺炎患者的新工具。这一工作正在发表之中，我校博士研究生石榴同学为论文第一作者，李根喜教授与中国科技大学罗昭峰教授、南京市第二医院检验科李金龙副主任为共同通讯作者。
总之，为了尽快完成新冠肺炎的病例确诊和高危人群排查，发展快速、便捷、廉价的现场检测技术是重中之重。然而，现有的病毒检测手段成本高、检测时间长、操作步骤繁琐，而且需要专业人员操作，因而不能很好地满足疫情大规模爆发时对诊断排查的需求。近年来，新型核酸扩增技术、生物传感技术和纳米技术的发展为分子诊断技术开辟了新局面，使高效、便捷、灵敏的分子诊断方法成为可能。期望相关基础研究能够为新冠肺炎疫情防控提供更好的技术支持。
信息来源：南京大学
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