Nat Neurosci：人脑类器官神经振荡和癫痫样改变的鉴别

正文(KSPG) 

利用类器官融合技术将单独生成的皮质和皮质下类器官结合起来，源于H9hESC或野生型iPSC系通过图1a分化方案定向于Cx（大脑皮层）或GE（神经节隆起）身份，类器官表现出皮质特征。

随着培养时间的推移，GE类器官内的许多神经元表达GABA能抑制性神经元标志蛋白，如GAD65、GABA以及各种中间神经元亚型的标志蛋白（图1b）。使用腺病毒（AAV）CAG:TDT标记GE类器官，观察到tdTomato+细胞从GE广泛迁移，并在相邻Cx内分散，因此在融合后2周，约18%的Cx细胞为tdTomato阳性（图1a、c）。

抑制性中间神经元在Cx区具有高度的重复性，最终约25%的细胞具有GABA特性（图1d）。相比之下，Cx+Cx融合仅表达神经元标记物SATB2，只有少量GAD65+DLX5+细胞（图1d）。Cx+GE类器官内兴奋性和抑制性中间神经元的整合通过兴奋性突触的连接，这两种突触以邻近的VGLUT1+突触前和PSD95+突触后斑点，以及VGAT和GEPHYRIN的抑制性突触为特征（图1e）。

相比之下，Cx+Cx类器官主要只包含兴奋性突触点（图1e），表明Cx+GE类器官中的大多数抑制性突触是GE衍生的。

图1融合脑类器官的制备与表征

为了确定融合类器官的生理活性范围，利用基于活体双光子显微镜的完整类器官钙指示剂成像和LFP的细胞外记录（图2a）。在感染AAV1Syn:GCaMP6f病毒后，测量了自发钙活性荧光的变化（图2b）。

Cx+Cx和Cx+GE融合类器官显示出可比较的基线神经活动（图2c）。然而，当添加GABAA受体拮抗剂BMI来评估抑制作用时，只有Cx+GE融合显示GABA能中间神经元和谷氨酸能细胞之间的功能连接。拮抗剂在Cx+GE融合过程中引起几乎完全同步的重复波（图2c，d）。

GE衍生的抑制性中间神经元的存在刺激兴奋性皮质网络的成熟。此外，这些数据表明中间神经元在Cx+GE融合中独特地参与兴奋性细胞的行为，由此产生的网络可以产生复杂的振荡波，这与完整大脑的颅外和颅内记录所观察到的振荡类似。

图2cx+GE融合类器官表现出复杂的神经网络活动，包括振荡节律

雷特综合征是一种神经发育障碍，通常由X染色体上MECP2基因的从头突变引起，作者利用Cx+GE融合类器官模拟雷特综合征模型，随后研究MECP2突变的类器官神经发生和命运的改变。对融合前第56天的Cx和GE类器官，第70天和第100天的Cx+GE融合类器官进行了单细胞RNA测序。

UMAP分析显示9个表达细胞类型特异性标记物的聚类，并且MECP2突变样本中有加速成熟和中间神经元形成改变的趋势，同时绘制了每一簇相关的典型标记物的表达图。

鉴于中间神经元功能对融合类器官中神经振荡的重要性，作者分离了抑制性神经元群，进一步区分中间神经元亚型，发现了七个主要的亚群，表达一些标记物，如DLX2、DLX5、GAD2、SLC6A1、SLC32A1、LAMP5，SCGN和TAC1。

重要的是，MECP2突变体类器官在突触形成中存在缺陷，神经元具有高兴奋性和高同步性，并且表现出异常的神经振荡，而中间神经元MECP2缺陷导致神经网络功能失调（图3、4）。MECP2突变类器官中上调的基因与神经元投射、形态发生和突触组装相关的基因有关，而下调的基因与mRNA分解代谢、内质网（ER）靶向和蛋白质翻译有关。

图3雷特综合征融合类器官显示GE依赖的超同步神经网络活动

图4雷特综合征融合类器官显示GE依赖性癫痫样改变

结果表明，pifithrin-α可以调节更多的上游兴奋性-抑制性神经元的生理相互作用，从而使神经网络水平的功能得到更全面的恢复，这些发现进一步说明了融合类器官建模方法在个性化药物发现中的潜在价值。

总的来说，这些实验证明了Cx+GE类器官中存在高度复杂的生理活性，与其细胞结构和细胞复杂性一致。

作者还通过免疫组织化学观察到突变类器官中SST表达相对减少，尽管在scRNA-seq数据中未观察到这一点。并且发现突变类器官中兴奋性突触点增加，可能与scRNA-seq分析揭示的转录组学变化有关。

MECP2突变类器官中差异表达的基因与轴突生长、突触形成、孤独症风险和癫痫密切相关，兴奋性输入的相对增加可能进一步导致神经振荡的中断，并使类器官易于过度兴奋。

编译作者:  原代美少女 (Brainnews创作团队) 

校审: 胖兔子可可 (Brainnews编辑部)