南京大学曹毅/王炜《PNAS》：均质工程水凝胶用于控制干细胞谱系规范!

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在组织中，细胞存在于复杂的细胞外微环境中，其机械特性在常规组织稳态或疾病发展过程中经常在空间和时间上发生变化。大量的研究结果表明，局部机械性能的变化会对细胞命运产生相当大的影响，如复杂的局部机械环境会强烈影响伤口愈合和组织再生。水凝胶广泛用于细胞培养、组织工程和柔性电子产品。对于由单体聚合制备的水凝胶，局部单体浓度的变化和化学反应释放的热量会导致水凝胶网络中的各种缺陷。对于通过聚合物化学交联制备的水凝胶，聚合物分子量的广泛分布及其凝胶化前的不均匀混合也会导致局部机械性能的显着变化。尽管大量研究致力于优化刚度、应变、韧性和动态机械响应，但很少考虑水凝胶的机械均匀性。

鉴于此，南京大学曹毅教授和王炜教授研究团队开发了一种基于主客体化学的方法来控制马来酰亚胺-硫醇交联聚（乙二醇）水凝胶的均匀性。这种方法是通用的，可以改善所得水凝胶的许多机械特性。机械同质性在控制人类胚胎干细胞的分化或干性维持方面起着重要作用。不均匀的水凝胶会破坏肌动蛋白的组装并导致转录调节因子（YAP）激活水平降低，而均匀的水凝胶会促进机械转导。因此，这项研究开发的最小化水凝胶机械不均匀性的方法可能在细胞培养和组织工程中具有广泛的应用。相关工作以“Engineering hydrogels with homogeneous mechanical properties for controlling stem cell lineage specification”为题发表在国际顶级期刊《PNAS》上。

水凝胶的制备和表征

作者使用β-CD作为潜在的客体分子来保护马来酰亚胺免受预凝胶溶液中的硫醇基团的影响，从而降低凝胶化率（图1）。马来酰亚胺的琥珀酰亚胺环相对疏水，可以通过疏水作用与β-CD的内腔结合。一旦形成主客体复合物，马来酰亚胺的琥珀酰亚胺环就变得无法进入硫醇基团。结果表明，通过β-CD-马来酰亚胺主体-客体化学减缓马来酰亚胺-硫醇反应动力学，从而成功生成均质水凝胶（图2）。值得注意的是，使用这种方法制备的四臂PEG水凝胶具有更少的网络缺陷和更均匀的机械性能（图3）。其中不含β-CD的非均质水凝胶和含有β-CD的均质水凝胶分别称为I-凝胶和H-凝胶。

图1水凝胶的制备

图2水凝胶的反应动力学表征

图3水凝胶的性能表征

同质性对hESC干性维持和分化的影响

为了研究水凝胶均匀性对在两种水凝胶上培养的hESC分化的影响，作者在12孔的细胞培养板中制备水凝胶，没有水凝胶的孔（玻璃表面）用作对照来研究（图4）。在细胞聚集体方面，hESCs很好地粘附在水凝胶和对照玻璃基板上，但表现出不同的形态。I-gels上的hESCs仍然是细胞聚集体，只有少量细胞分离并散布在凝胶上。相比之下，几乎所有的hESC都是单独生长的，并在H凝胶上采用了展开的构象。在I凝胶、H凝胶和玻璃基板上作为细胞聚集体保留的细胞百分比分别为59.4、5.0和81.7%。在细胞干性方面，H-凝胶上的细胞中的Oct3/4和Sox2均显着降低，表明均质水凝胶可能降低干性并促进hESC的分化。所有的实验结果表明，水凝胶的均匀性可以显着影响干细胞的分化和干细胞维持。

图4同质性对hESC干性维持和分化的影响

H-凝胶上增强的机械转导

为了了解均质H凝胶和I凝胶上不同细胞命运承诺的潜在机制，作者使用分子标记免疫染色研究了I凝胶和H凝胶上细胞的形态、细胞骨架结构和粘附斑块（图5）。hESC细胞核的平均扩散面积在两种类型的水凝胶之间存在显着差异。H凝胶和I凝胶的平均核面积分别为~122和~38 μm²。H凝胶上细胞的受压肌动蛋白束比I凝胶上的细胞更长、更有条理。在H凝胶上观察到点状桩蛋白，表明它们聚集在细胞表面形成成熟的粘着斑。相比之下，在I-gels上观察到的扩散桩蛋白比在H-gels上越来越少。所有这些结果表明，在H凝胶上生长的hESC比在I凝胶上生长的hESC显示出更有效的机械转导。

图5 H-凝胶上增强的机械转导

小结：作者报告了一种通过使用主客体化学降低凝胶速度来最小化合成无污染马来酰亚胺-硫醇交联PEG水凝胶的机械异质性的方法。这种方法是通用的，可以改善所得水凝胶的许多机械特性。此外，研究表明基质刚度的纳米级变化可以显着影响hESC的谱系规范，这在当前的许多干细胞研究中并未得到认真考虑。鉴于活组织中机械模式的组织会受到损伤和疾病的极大影响，这项工作的结果可能会提高人们对疾病进展和伤口愈合过程中机械转导的理解。

全文链接：

https://www.pnas.org/content/118/37/e2110961118

来源：高分子科学前沿

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