用于肿瘤联合免疫治疗的响应型双靶向外泌体|山东师范大学唐波教授课题组研究新进展

山东师范大学唐波教授团队提出了一种以内源性外泌体为药物载体，同时携带多种免疫药物进行肿瘤联合免疫治疗新策略。该药物载体生物相容性好、毒性低，具有同时激活免疫响应和抑制免疫逃逸的协同优势。该研究成果以题为“Responsive Dual-Targeting Exosome as a Drug Carrier for Combination Cancer Immunotherapy”发表在Research上。

Citation: Yuanyuan Fan, Yingshun Zhou, Meng Lu, Haibin Si, Lu Li, Bo Tang, "Responsive Dual-Targeting Exosome as a Drug Carrier for Combination Cancer Immunotherapy", Research, vol. 2021, Article ID 9862876, 12 pages, 2021. https://doi.org/10.34133/2021/9862876

近年来，肿瘤免疫治疗取得了一系列成功的临床结果，引起了极大关注。最初的治疗策略主要依靠免疫激活药物实现免疫系统的激活和增强，然而，肿瘤的免疫逃逸往往导致免疫治疗的失败。因此，在免疫激活药物的基础上增加免疫逃逸抑制剂，二者联合用药是改善免疫治疗效果的关键。但由于大多数药物在人体内分布广泛，直接注射多种药物可能导致药物的非特异性释放，很难获得理想的治疗效果。因此，开发多功能药物载体用于递送多种药物，同时通过靶向修饰以改善肿瘤药物非特异性释放的问题对于实现联合免疫治疗至关重要。

目前已有多种纳米材料广泛用于多种药物的同时递送，但仍然存在一些问题。例如，纳米材料的免疫排异反应和潜在毒性，在血液运输过程中，各种蛋白质的吸附形成“蛋白冠”对其稳定性和靶向能力的影响等。

外泌体是一种纳米级双层膜结构的囊泡颗粒，它为药物的有效装载提供了一定的内部空间，在药物递送方面表现出更大的灵活性。此外，与其他纳米材料相比，外泌体来源于活细胞，具有低免疫原性和高生物相容性，并且不存在“蛋白冠”吸附的问题。这些都有利于药物在血液中的稳定运输以及在肿瘤部位的特异性释放。因此，利用外泌体作为药物载体将为肿瘤联合免疫治疗提供新的思路。

山东师范大学唐波教授团队设计了一种基于外泌体的药物递送载体，该载体可以同时携带多种免疫药物（图1）。

首先将DSPE-PEG-anti-CD40和DSPE-PEG-PLGVA-anti-PD-L1以及免疫激活药物cGAMP一起与供体细胞孵育，亲脂性DSPE可以嵌入细胞膜，使抗体被修饰在供体细胞表面，同时药物cGAMP可被供体细胞摄取。当细胞分泌外泌体时，细胞表面的两种抗体以及药物均可一起转移到分泌的外泌体上，最终通过差速离心法获得双靶向载药外泌体（图1A）。其中，两种抗体（anti-PD-L1和anti-CD40）不仅作为靶向分子，还作为免疫检查点抑制剂和共刺激分子，以提高治疗效果。

当双靶向载药外泌体聚集在肿瘤组织时，多肽PLGVA被肿瘤微环境中的丰富的基质金属蛋白酶MMP-2切割，与其相连的anti-PD-L1与载药外泌体分离，进而结合肿瘤细胞膜上的PD-L1受体以抑制肿瘤细胞的免疫逃逸。随后，外泌体表面的另一种抗体anti-CD40引导外泌体靶向树突状细胞（DCs）膜上的CD40受体，二者的结合给予DCs第一个正刺激信号。然后外泌体被DCs内吞并将药物cGAMP释放，cGAMP通过激活STING信号通路给予DCs第二个正刺激信号（图1B）。通过对DCs的两次激活和对肿瘤细胞PD-L1的阻断，免疫治疗效果可以得到极大提高。

图1  用于肿瘤免疫治疗的双靶向和载药外泌体的构建（A）及作用机理（B）示意

首先，作者对差速离心法所获取外泌体的形态、尺寸、标志性蛋白进行了表征（图2A-C），证明获取的外泌体完整、纯净，可以用于下一步的修饰。随后作者通过共聚焦成像以及流式细胞术探究了DSPE对供体细胞膜的嵌入能力，结果表明DSPE能够嵌入受体细胞膜表面（图2D），并且该受体细胞分泌的外泌体同样也携带有荧光，说明受体细胞能将细胞膜上嵌入的分子传递给分泌的外泌体（图2E、F）。

图2  外泌体的表征（A-C）、DSPE细胞膜嵌入的验证（D）以及提取外泌体的荧光强度分析（E、F）

接下来作者将DSPE-PEG-anti-CD40、DSPE-PEG-PLGVA-anti-PD-L1以及免疫激活药物cGAMP与受体细胞共孵育，随后提取分泌的外泌体，并探究获取的双靶向载药外泌体的靶向能力及树突状细胞激活能力。共聚焦荧光成像结果显示，构建的双靶向载药外泌体成功靶向了黑色素瘤细胞及树突状细胞，并且随着孵育时间的延长细胞内积累的外泌体增多，说明其对肿瘤细胞及免疫细胞都具有特异性靶向能力（图3A、B）。另外，通过检测树突状细胞细胞因子的分泌水平，发现双靶向载药外泌体处理的细胞所分泌的三种细胞因子水平均高于其他对照组，证明了该双靶向载药外泌体对树突状细胞有很强的激活作用（图3C）。

图3  双靶向载药外泌体对黑色素瘤细胞及树突状细胞靶向能力的验证（A、B）及小鼠血清中三种细胞因子分泌水平的检测（C）

随后，作者尝试利用构建的双靶向载药外泌体对黑色素瘤小鼠进行治疗。将外泌体注射到黑色素瘤小鼠体内并记录小鼠的体重、存活时间以及肿瘤大小，结果显示，同时修饰两种抗体并且装载有免疫激活药物cGAMP的双靶向载药外泌体治疗后的小鼠存活时间最长、肿瘤体积最小，证明双靶向载药外泌体对黑色素瘤有较好的治疗效果（图4）。

图4 双靶向载药外泌体的小鼠肿瘤治疗效果

最后，作者获取了小鼠肿瘤组织切片并进行H&E染色，结果显示，双靶向外泌体治疗后的肿瘤细胞大量坏死，而PBS处理组中坏死肿瘤细胞数量较少（图5A）。为了进一步探究构建的双靶向载药外泌体对小鼠的免疫系统激活能力，作者利用免疫荧光染色观察到小鼠肿瘤组织切片中，外泌体治疗后杀伤型CD8+T细胞数量较多，PBS处理组中CD8+T细胞数量较少（图B）。作者最后检测了小鼠血清中细胞因子的表达水平，发现双靶向载药外泌体治疗组中三种细胞因子表达水平均为最高，其他对照组中相对较低，表明该双靶向载药外泌体能够成功激活小鼠免疫系统并杀死肿瘤细胞，实现肿瘤免疫治疗（图C）。

图5  双靶向载药外泌体治疗后小鼠肿瘤切片的H&E染色（A）、免疫荧光染色（B）及细胞因子分泌水平（C）的研究

基于生物内源性外泌体，作者能够构建了携带多种免疫药物的功能化药物载体。该药物载体毒性低、生物相容性好，通过多种免疫药物的递送能够同时激活免疫反应和抑制免疫逃逸，实现了肿瘤的联合免疫治疗。该策略为外泌体的药物装载及靶向分子修饰提供了一种通用的方法，还可以推广到其他多种疾病的治疗，以实现低毒、高效的药物特异性输送。

唐波教授现任山东师范大学教授、博士生导师，教育部科技委学部委员，973计划首席科学家，国家杰出青年科学基金获得者，“新世纪百千万人才工程”国家级人选。主要从事分子及纳米荧光探针的合成及其在生物成像中的应用、绿色化工、荧光材料合成及太阳能化学转化与储存等方面研究工作，2019年唐波教授团队的“细胞稳态调控活性分子的荧光成像研究”项目获得国家自然科学奖二等奖。

李璐教授现任山东师范大学教授、博士生导师。山东省自然科学杰出青年基金，山东省泰山学者青年专家。目前主要从事单细胞、单颗粒、单分子分析研究，主持多项国家自然科学基金重大研究计划培育项目、面上基金等多项国家级和省部级项目。