禽流感病毒研究进展及抗H7N9型病毒疫苗与抗体研究

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引用本文：王雨潇, 李靖欣, 刘沛, 等. 禽流感病毒研究进展及抗H7N9型病毒疫苗与抗体研究[J]. 中华流行病学杂志, 2021, 42(9): 1700-1708. DOI: 10.3760/cma.j.cn 112338-20210323-00242.

作者：王雨潇，李靖欣，刘沛，朱凤才

摘要

Abstract

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）是一种可引起急性呼吸道传染病的人畜共患病毒。自2013年我国出现了全球首例人感染H7N9型AIV病例以来，人们对该病毒产生了担忧与恐慌。AIV在全球广泛传播，人感染不同型别AIV事件也持续发生，造成了巨大的经济损失。目前尚无针对该病的特异性治疗措施与药物，疫苗成为最有可能预防控制病毒传播的手段。现有针对H7N9型AIV的兽用与人用疫苗种类繁多，其中，4类人用H7N9型AIV疫苗已经率先进入了临床试验阶段，主要包括了病毒样颗粒疫苗、减毒活疫苗、灭活疫苗及DNA疫苗，并显示出了良好的安全性和免疫原性。因为暂无上市的人用AIV疫苗，所以其真实效力不得而知。此外，现有的流感疫苗在人群中虽然具有良好的安全性和免疫原性，但对H7N9型AIV并无交叉抗体反应。本文回顾AIV的病原学、流行病学、职业暴露人群调查与防控策略、H7N9型AIV疫苗及H7N9型AIV全人源单克隆抗体研究进展，讨论尚存的问题和挑战以及未来的发展方向，为加深对疾病的了解以及控制AIV在全球的蔓延提供防控策略与方针。

【关键词】流感病毒；禽流感病毒；H7N9型；单克隆抗体；疫苗；临床试验

前言

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）是21 世纪令人关注的可引起人畜共患急性呼吸道传染病的病毒之一。早在1997年，中国发生的一次家禽疫情中报告了人类感染H5N1型AIV的病例。AIV自2003年以来从亚洲传播到欧洲和非洲，并在部分地区的禽类中根深蒂固。由于H7N9 型AIV过去只在禽类传播，从未感染过人类，因此人群对该病毒普遍没有保护性抗体。然而在2013年3月，中国出现了世界上首例人感染H7N9型AIV的病例^［¹^］。此后共发生了6次H7N9型AIV流行的疫情，前4次（从2013年3月至2016年7月）流行的毒株是低致病性AIV（low pathogenic avian influenza virus，LPAIV），第5次（2016年8月至2017年7月）流行的毒株中出现了高致病性AIV（highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV），并体现为出现早、上升快、强度高、分布广的特征，这引起了社会对AIV疫情的高度关注^［²^］。根据中国CDC公布的数据显示，截至2019年9月，我国H7N9型AIV感染例数1 626例，死亡624例，病死率达38%，其中有201名患者有明确禽类接触史^［³^］。2013年我国《传染病防治法》将AIV列为乙类传染病并实行甲类管理^［⁴^］。

随着预防疾病意识的提升和医疗卫生条件的改善，前5次疫情很快被抑制住，仅有零星病例在世界各地散发，到2017年疫情后未见新增H7N9型AIV病例报道。然而其他型别的AIV疫情依然活跃于世界各地。例如在2005年至2020年期间，欧洲至少发现了10起H5型HPAIV入侵事件，导致了家禽和野生鸟类的大量死亡^［⁵^］。在孟加拉国，H5N1型HPAIV和H9N2型LPAIV目前在家禽中流行，并有记录显示该两种病毒可感染人类^［⁶^］。根据WHO报道统计数据显示，截至2020年10月，全球17个国家共报道862例H5N1型AIV感染病例，并导致455例死亡病例。H5N9型、H9N2型和H7N7型AIV均造成了散发的人类感染。此外，在挪威及加拿大等地区还发生了人感染猪流感H1N1和H1N2型病例^［⁷^］。

AIV在全球广泛传播并对公众健康构成了巨大威胁，本文针对AIV的病原学、流行病学、职业暴露人群调查与防控策略以及H7N9型AIV全人源单克隆抗体研究进展进行综述，为加深对该疾病的了解提供参考。

一、AIV病原学

AIV属于正粘病毒科甲型流感病毒属。AIV颗粒呈多形性，其中球形直径80~120 nm，有核心和囊膜组成。病毒基因组由两型表面糖蛋白（血细胞血凝素HA和神经氨酸酶NA）、核蛋白（NP）、多聚酶蛋白（PB1、PB2、PA）、基质蛋白（M1、M2）和非结构蛋白（NS1、NS2）组成^［⁸^］。根据不同种类病毒HA和NA的结合情况，甲型流感病毒又可分类为多种不同亚型。其中，HA共有18个亚型（H1~H18），NA则有11个亚型（N1~N11）^［⁹^］。目前，已知的AIV传染给人的亚型主要包括H3、H5、H7、H9。依据病毒的不同致病性，又可将其划分为低、中、高致病性。其中，H9N2和H6N8亚型中一些毒株为中致病性，H5和H7亚型中若干毒株为高致病性，其余为低致病性。

由于AIV包含了8个单股负链RNA片段，AIV的复制是通过RNA依赖的聚合酶完成的，而聚合酶缺乏校正功能，所以AIV发生基因突变的频率极高。HA、NA以及PB2蛋白的突变可能导致了不同的病毒学特征。因此，在2017年出现了新的基因型以及H7N9型HPAIV^［10^］。目前已有研究表明H7N9型AIV正在不断变异，以便更适应对哺乳类动物的感染^［⁶^］。根据荷兰伊拉斯莫斯医学中心的研究报告显示，2009年前欧洲地区H5型HPAIV的暴发是由2.2种系的病毒引起的，而从2014年起，则转变为HPAIV 2.3.4.4种系的病毒主导了暴发，大量的基因重配产生了H5N1、H5N2、H5N3、H5N4、H5N5、H5N6和H5N8亚型^［⁵^］。由此可见，不同种系的多重病毒导入、基因型重配以及持续多样化等现象创造了一个复杂的病毒学环境，这可能导致今后病毒毒性的增强、增加对新宿主的适应性，以及人畜共患疾病的大规模传播^［⁶^］。另外值得一提的是，甲型流感病毒根据宿主源也可以分类为AIV、猪流感或其他类的动物流感病毒。除了人们熟知的H5N1、H9N2、H7N9均为AIV亚型，H1N1和H3N2型则为猪流感病毒亚型。由于猪有可能感染来自多种不同宿主（如鸟类和人类）的流感病毒，它们有可能扮演“搅拌舱”作用，促进不同的流感病毒基因进行重配并产生“新型”流感病毒。虽然这些甲型动物流感病毒有别于人类流感病毒不容易在人与人之间传播，但是这种“新型”重配病毒逐渐适应哺乳动物和人类，并可能获得人际传播的能力，或导致人类罹患与原病毒相比更加严重的疾病。

二、AIV流行病学

1. 传染源、传播途径及易感人群：

目前，普遍认为候鸟和水禽是多数甲型流感病毒亚型的天然宿主。近年来也有临床案例证明AIV也可感染猪、马、海豹和鲸等各种哺乳动物及人类。而乙型和丙型流感病毒则分别多见于海豹和猪的感染。AIV可引起禽类从呼吸系统到严重全身败血症等多种症状的病毒性流行性感冒。根据引起疾病严重的程度亦可以将AIV划分为HPAIV和LPAIV。该病毒在鸟类间易于传播流行，可以通过候鸟的迁徙实现远距离传播，过去俗称 “鸡瘟”，其特征主要为家禽、水禽及野禽的大面积突然死亡。

人感染AIV的途径主要是通过呼吸道传播，也可通过接触带毒禽类及其排泄物、分泌物以及受其污染的环境及物品、水源等进行传播。当前AIV尚未发现人传人的直接证据，主要呈散发状态，大部分病例有明确的活禽接触史，少数无明确的暴露原因。在市场环境抽查中几乎全年都能检测到H7N9型AIV，而病例还是以散发为主，发病人数只占暴露人群的极少数，流行病学提示人群普遍不易感。

2. 临床症状、抗病毒治疗及预防控制措施：

人类感染AIV后的潜伏期一般为7 d以内，主要症状为流感样症状，如发热、咳嗽、咳痰，有时则伴有肌肉酸痛、头痛和周身不适等症状，随着病情加重可表现为高热、重症肺炎、呼吸困难，甚至急性呼吸窘迫综合征、休克、多器官功能障碍综合征等乃至死亡^［^11-12^］。

临床上治疗人感染 AIV的抗病毒药物主要有离子通道 M2 阻滞剂和NA抑制剂。离子通道 M2 阻滞剂如金刚烷胺和金刚乙胺对甲型流感病毒有作用，但对乙型流感病毒无效。目前，研究发现AIV对金刚烷胺和金刚乙胺已经产生了耐药性^［¹³^］。此外，该类药物都伴随着胃肠道和中枢神经系统的不良反应，例如头晕、精神不集中、焦虑、失眠、有癫痫病史的诱发癫痫等，因此不建议使用。NA抑制剂主要包括了帕拉米韦、扎那米韦和奥司他韦等，尤其是奥司他韦，能够大幅度提高患者存活率，因此，成为治疗人感染AIV一线药物。它们能有效改变病毒活性位点NA的结构。在发病早期使用抗病毒药物如奥司他韦等，可以最大限度地降低病死率及重症病例的发生，应尽早给疑似病例服用奥司他韦（理想状况下是在症状出现后的48 h之内），以达到最佳疗效。但应注意H7N9病毒NA基因突变对NA抑制剂产生耐药性。考虑到目前与甲型H5和甲型H7N9亚型感染相关的高病死率以及这些疾病中病毒长时间复制的证据，对那些在病程较后期就诊的患者也应考虑给药。非重症患者不建议使用皮质类固醇类药物，由于该类药物具有依赖性且可能诱发并发症或者加重感染。对于甲型H5或甲型H7N9病毒严重感染的病例，临床医生可能需要考虑增加每日建议的服药剂量或延长治疗时间。

我国针对疫情实行的解决方案主要有及时扑杀病禽、大规模禽类接种流感疫苗和生物安全改进。因为当前AIV尚未发现人传人的直接证据，但大部分病例有明确的活禽接触史，所以控制AIV在家禽中流行对减少人类感染的风险是至关重要的。针对禽类的管理则从制定适宜的免疫和保健方案入手，同时定期监测种群的免疫和防控情况，可有效降低H7N9型AIV在家禽及人类中流行风险。考虑到不同亚型AIV的重组变异可能会形成新的基因型，因此开展基于病毒宿主及环境样品采集检测的活禽市场AIV监测，发现市场可能存在的高污染风险区域，同时联合卫生和农业部门开展区域之间的联合防控，对市场禽类及环境AIV的污染情况进行动态监测。

在人群方面，加强对不明原因肺炎的主动监测，特别是在疫情流行季节，早期发现可疑病例并服用抗病毒药物从而减少重症的发生；及时发现病毒耐药株对患者后期治疗也尤为重要。此外，对人群进行宣传教育，提高人群对人感染AIV的认知程度，呼吁勤洗手，注意个人防护，尽量减少与禽类不必要的接触。

三、AIV职业暴露人群调查研究进展

AIV在家禽中普遍存在，这不仅对禽类产业链是一个巨大挑战，而且给国家经济以及公共卫生造成了负面影响^［¹⁴^］。由于目前我国家禽养饲养总量大、密度高、种类多且已知AIV在养殖场和活禽市场中普遍流行，而这又是人类感染AIV的主要暴露场所，所以这也明显增加了养殖工人和其他工种等职业暴露人群的感染风险，并且该人群可能成为AIV向一般人群传播的桥梁。此外，大规模的跨区域活禽运输和交易，人为地增加了病毒重配机会，提高了产生新型流感病毒的可能性。对于AIV，人类感染的首要危险因素似乎是直接或间接暴露于受感染活禽或病死禽类或污染环境中，例如活禽市场。屠宰感染的禽类、拔毛和处理尸体及制备供食用的禽类，尤其是在家庭环境中，也有可能成为危险因素^［¹⁵^］。猪作为流感病毒的混合器，其可同时感染多种AIV并且存在不同物种病毒混合存在的情况^［¹⁶^］，使得流感病毒在人、禽、猪之间跨种传播比较普遍。对于猪流感病毒，多数人间病例中报告曾近距离接近染病的猪或到达过有猪的地方，但也发生过一些有限的人际传播。因此，除了禽类职业接触者以外，职业接触猪的暴露人群也是多发人群。

1. 我国职业暴露人群AIV感染调查：

目前多篇文献全面的分析和评价职业暴露人群感染AIV的发病情况和相关危险因素。有文献统计，在中国，人感染H5N1型AIV的总体血清流行率为2.45%，而来自中国中部地区的人感染H5N1的血清流行率为7.32%，高于中国其他地区^［¹⁷^］。职业暴露人群或者暴露于患者及病禽的人群H5N1型AIV血清学阳性率明显高于一般人群^［¹⁸^］。最近有学者针对H7N9型AIV的血清学调查结果进行了总结归纳，结果显示全人群的阳性率在0.122%（95%CI：0.023%~0.275%），感染风险较低^［¹⁹^］。然而职业暴露人群或者暴露于患者及病禽的人群的阳性率则为1.075%（95%CI：0.000%~4.357%）。在北方地区（北京市）对禽类从业者感染H9N2型AIV的情况进行了4次血清学抽样调查，结果显示2016年4月家禽从业人员抗体阳性率最高为2.77%，2015年4月普通人群阳性率最低为0.09%，但感染H9N2型AIV的风险依然高于普通人群^［²⁰^］。在南方地区（无锡市），468名家禽从业人员的随访中，H7N9、H9N2和H5N1型AIV的血清转化率分别为0.43%、2.78%和1.50%^［²¹^］；H9N2型AIV在世界范围内传播，主要在家禽中传播。它在家禽和哺乳动物中的传染性和适应性日益增强，增加了人类感染的可能性。然而，由于H9N2型人类病例的临床症状较轻，很难发现。另外一项研究共收集了来自中国22个省份职业暴露人群的15 700份血清样本，采用血凝抑制（HI）和微量中和（MN）检测。H9N2型的血清阳性率在活禽市场工人、大型家禽养殖户和后院养殖户中显著高于家禽屠宰厂工人和野鸟栖息地维护人员。在华南地区的血清阳性率显著高于北方，这可能是由于家禽密度较高造成的。血清阳性率最高的是老年人，其次是中年人，然后是年轻人，这或许是因为老年人中较长时间的家禽接触史所导致的。由此可见，人感染H9N2型AIV在我国分布广泛^［²²^］。2014-2016年，有研究显示14 407名家禽工作人员的2 124份血清样本中H9N2、H7N9、H6N1、H5N1-SC29、H5N6、H5N1-SH199和H6N6型AIV的血清抗体普遍存在^［²³^］。

2. 国外职业暴露人群AIV感染调查：

在其他国家，例如巴基斯坦家禽从业人员中，总体抗H9的抗体阳性率高达50.3%。其中，操作间工作人员的血清阳性率最高（100.0%），兽医最低（38.5%），而接种人员、屠夫和农场工人的血清阳性率分别为83.3%、52.4%和45.5%。此外，该研究还发现使用口罩者的血清阳性率（29.6%）明显低于未使用口罩者（90.6%）（P<0.002）。经常使用手套和肥皂洗手的人的血清患病率为32.8%，而那些从不采取预防措施的人的血清患病率为89.0%^［²⁴^］。在埃及也发现禽类养殖者中AIV血清阳性率高于一般人群^［²⁵^］。在印度尼西亚，2013年在活禽市场工作人员中也有着较高的H5N1型AIV感染率^［²⁶^］。由此可见，AIV抗体不仅在我国家禽及职业暴露人群普遍存在，同时在世界多个禽类养殖业发达的国家中流行。在欧洲野生和家养鸟类中检测到的H5型HPAIV大部分都与秋季西南/西移和冬季当地水鸟大规模聚集相吻合^［⁵^］。此外，近年来研究发现家养猫犬及动物收养所亦可以作为AIV新型传播媒介，并在收养所工作人员出现无症状感染^［^27-28^］。

现有大量针对AIV职业暴露人群感染的流行学调查研究证明了家禽接触人群中H5、H7、H9血凝抑制抗体阳性率明显高于一般人群^［^29-31^］。另外，职业暴露人群中还存在H4、H5、H7、H9、H11等多种亚型AIV的隐性感染^［^32-37^］。这些结果均可用于评价AIV职业暴露人群感染率与发病率，评估相关环境中不同亚型AIV的分布情况，掌握影响职业暴露人群的危险因素，这也为将来流感病毒的预防和控制提供参考意见。由于该病毒在动物和环境中不断被发现，并且继续存在活禽兜售情况，因此预计还会发生更多人间病例。有必要对家禽工作人员进行更密切的监测和加强保护措施。WHO建议，前往已知发生AIV疫情的国家旅行的人应尽可能避免接触家禽养殖场，或避免与活禽市场中的动物接触，或避免进入可能宰杀家禽的场所，或避免接触看似受到家禽或其他动物粪便污染的任何表面。旅行者还应经常用消毒剂与流动清水洗手，并应遵守良好的食品安全和饮食卫生习惯。

四、H7N9型AIV疫苗临床研究进展

目前因为没有针对H7N9型AIV的特效药物和治疗措施，所以从抗体入手以寻求被动免疫制剂和特效疫苗是最佳应对手段。抗H7N9型AIV疫苗依据适用对象可以分为人用疫苗及禽类疫苗。目前我国推行的家禽疫苗接种计划主要采用的疫苗是H5和H7重组双价灭活疫苗，据悉总体免疫接种率超过80%。通过近年来持续的流行病学监测，只有极少数样本的检测结果为H7N9型阳性（2017年12月8万多份样本中有11份）。同时期也仅有3例H7N9型人感染病例，而在疫苗推广之前感染患者人数则超过700例^［³⁸^］。由此可见，在禽类中推行AIV疫苗对保护人群免受感染的重要性及必要性。

自2013年人感染H7N9型AIV事件发生以来，研究者进行了大量针对人用AIV疫苗的研究，现有AIV疫苗种类繁多，主要分为传统疫苗（灭活疫苗和减毒活疫苗）、重组蛋白疫苗、病毒样颗粒（VLPs）疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗（DNA疫苗、病毒载体疫苗及RNA疫苗）等，且在动物试验中取得了一定的预期结果。此外，AIV疫苗也进入了临床试验阶段，共计180多项已经完成或者正在进行中。

根据临床试验注册网数据库显示，针对H7N9型AIV候选疫苗共计26个注册临床试验，其中主要包括了病毒样颗粒疫苗、流感病毒减毒活疫苗、流感病毒灭活疫苗及DNA疫苗。

1. H7N9型AIV减毒活疫苗：

H7N9型AIV减毒活疫苗是将AIV经处理后保持活性不变，毒性结构改变，既保持了抗原性又达到减毒的目的。减毒活疫苗相比灭活疫苗可以更好地刺激体液、细胞和黏膜免疫应答，提供更持久的交叉免疫保护，单次剂量免疫机体即可产生免疫应答，且价格低廉。在动物模型体内表现出良好的稳定性，并且在没有佐剂的情况下也具有很强的免疫原性。在俄罗斯圣彼得堡进行的双盲随机安慰剂对照试验中，受试者每隔28 d鼻内给药2剂疫苗或安慰剂，结果显示安全性良好。第一剂疫苗后48%（95%CI：29.4%~67.5%）出现血清阳转，第二剂疫苗后72%（95%CI：52.8%~87.3%）出现中和抗体的血清转换^［³⁹^］。另一种针对长江三角洲血凝素系株型的减毒活疫苗在临床试验中同样体现出了良好的免疫原性，96.6%的受试者出现了免疫应答^［⁴⁰^］。然而，该类疫苗可能存在的缺点在于具有一定的残留毒力、毒力反复现象、产品保存运输条件高等。

2. H7N9型AIV灭活疫苗：

H7N9型AIV灭活疫苗是采用甲醛或者其他方法灭活处理，再辅助添加佐剂制备而成的一种疫苗。该类疫苗优点在于安全性高、免疫原性好、不出现变异反应。现存多种不同的灭活疫苗，其中，中国台湾地区研发的AT-501灭活疫苗在临床试验中显示含30 µg HA和氢氧化铝佐剂的H7N9型流感灭活疫苗对受试成年人具有免疫原性和安全性^［⁴¹^］。研究者们对另一种含AS03佐剂的灭活疫苗在18~64岁的健康成年人中进行了盲法研究。参与者被随机分组接种4种AS03佐剂疫苗（低或中剂量的血凝素与AS03A或AS03B）中的1种，或者一种非佐剂疫苗和安慰剂对照疫苗。在接受有佐剂配方的组中，血清阳转率和血清保护率分别≥85.7%和≥91.1%，而在非佐剂疫苗组中阳转率和保护率都明显降低分别为23.2%和28.6%。研究结果发现两剂AS03佐剂的H7N9型疫苗耐受良好，并在抗原保留剂量的健康成年人中产生了强大的抗体应答^［⁴²^］。此外，包含MF59佐剂的H7N9型AIV灭活疫苗也同样进行了Ⅱ期随机、部分盲法试验。受试者在接种三针次疫苗后产生了中度免疫反应性，而在不同抗原剂量或两种剂量免疫计划中抗体反应没有显著差异^［⁴³^］。为了探索MF59佐剂对于疫苗免疫原性的影响，临床试验将添加MF59佐剂与无佐剂的疫苗进行比较发现，包含佐剂的疫苗相比无佐剂疫苗能产生了更高的免疫应答并有着良好的耐受性^［⁴⁴^］。因为不同佐剂的添加对于疫苗免疫原性存在影响，所以有临床研究进行了对比并发现AS03和MF59两种佐剂增强了H7N9型流感灭活疫苗的免疫应答，其中AS03佐剂诱导的滴度最高^［⁴⁵^］。考虑到初免-加强策略在多种其他疫苗临床中能提供更加高效的免疫原性，研究者采取不同H7N9型AIV疫苗接种或相同疫苗加强免疫策略在临床试验中进行了验证，结果发现采用DNA疫苗初免-H7N9型单价灭活疫苗加强的接种策略对于预防疫情大流行有着良好的效果^［⁴⁶^］。

3. H7N9型AIV VLPs疫苗：

H7N9型AIV VLPs疫苗是含有一个或多个AIV结构蛋白的不含病毒遗传物质的，在形态上类似于病毒的蛋白空心颗粒。正是因为VLPs不含核酸，所以其最大的优点在于不具备感染性，安全性高，并且可以有效刺激机体的抗体产生，同时生产周期短、生产成本低、可以大规模生产，因此也是现在的研究热点^［⁴⁷^］。在临床试验中，含配伍皂素ISCOMATRIX™佐剂的VLPs疫苗相比无佐剂疫苗能显著增强免疫原性、促进人类对AIV更高质量的抗体免疫应答，提高抗野生型H7N9病毒侵袭能力^［^48-49^］。

4. H7N9型AIV DNA疫苗：

DNA疫苗又称为核酸疫苗，是将AIV的保护性抗原基因克隆到真核表达载体中并直接导入动物体内，抗原蛋白诱导机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫反应。该类疫苗的主要优点是可在体内细胞中表达抗原，诱导体液免疫和细胞免疫，安全性较高、生产成本低和不受母源抗体的限制等优点。Ⅰ期临床试验中采用DNA初免-H7N9型单价灭活疫苗加强的接种策略，结果显示该新型H7型DNA疫苗安全性高、耐受性好、免疫原性好，且具有更高的免疫诱导效价和中和抗体效价^［⁵⁰^］。此外，初免-加强策略还可以增强H5型或其他流感疫苗的效力^［^51-52^］。但是DNA疫苗的缺点也值得注意，外源基因进入宿主体内后有机会与宿主的基因组DNA整合从而使细胞发生癌变，另外 DNA疫苗也容易产生免疫耐受。

以上4类进入临床阶段的H7N9型AIV疫苗的免疫原性和安全性数据为进一步临床开发提供了有力依据。虽然人感染H7N9型AIV仍然是小概率事件，大规模使用疫苗的可能性不大，不过在疫苗技术储备方面未来具有战略性意义。

五、H7N9型AIV全人源单克隆抗体研究进展

作为一种新发的具有人感染性的AIV亚型，2013年发现的H7N9型AIV以其对人类的高致病性、高病死率，以及远高于H5N1型AIV的感染率而引起全球广泛关注^［^53-54^］。一般对于病毒感染来说，中和抗体的产生往往与感染的恢复和疾病的转归有着紧密联系。但是，与普通的H3N2型季节性流感病毒和2009年流行的H1N1型流感病毒不同，H7N9型AIV感染人体后，很难刺激机体产生较高的保护性抗体应答^［^55-56^］。有资料显示，部分病人可以在病毒感染后2周左右其外周血检测到中等水平的H7N9中和抗体的存在。这种相对较弱的中和抗体水平可能与H7N9型AIV的致病机制有关，预示着感染的病情更重、病程更长^［⁵⁷^］。此外，H1和H3型的中和抗体与H7N9型AIV的交叉中和作用非常低，机体内的H1和H3型的中和抗体无法保护H7N9型AIV的感染^［⁵⁶^］。因此，寻找具有中和作用的特异表位对发展有效的疫苗和抗体等药物具有至关重要的意义。

目前尚无针对H7N9型AIV的特异性的治疗药物和疫苗上市。抗流感病毒帕拉米韦、扎那米韦和奥司他韦等神经氨酸酶抑制剂对治疗H7N9型AIV的作用褒贬不一，其治疗效果可能与用药时间及病情轻重有关，尤其是在早期使用奥司他韦可以降低病死率及重症病例的发生。然而，随着病毒基因型别的突变均不同程度地对抗病毒药物产生耐药性，导致这些药物的治疗并不能完全抑制H7N9型AIV复制。另一方面，目前全世界尚无上市的人用H7N9型AIV疫苗，然而疫苗的研发受抗原免疫原性较低、受试者接种疫苗后产生保护性免疫反应所需的时间长以及疾病散发的流行状态的影响，疫苗的保护效果和成本效益可能都不尽理想^［^58-59^］。在这样的情况下，被动免疫可能是目前有效预防和治疗人感染H7N9型AIV的有效策略。

1. 单克隆抗体发展背景及过程：

单克隆抗体是继疫苗、重组蛋白后最重要的一类生物技术产品，可用于人类疾病的诊断、暴露后的预防、患者的治疗以及免疫机制的研究。单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。在过去的研究中，针对流感病毒的单克隆中和抗体在动物实验中显示出良好的治疗作用和预防保护作用^［⁶⁰^］。单克隆抗体主要历经鼠源性、嵌合、人源化和全人源单克隆抗体4个阶段。最初国内外针对H7N9型AIV的单克隆中和抗体研究多为鼠源性的单克隆抗体，由于鼠源性单克隆抗体由鼠杂交瘤细胞分泌，异质性非常强，可诱导产生人抗鼠抗体。有研究从接种过A/ZJU01/PR8/2013的H7N9型灭活疫苗的免疫小鼠身上制备得到2株抗LPAIV的HA小鼠单克隆抗体并对其进行了鉴定。这2个单克隆抗体，1H10和2D1，已经在小鼠被动传播病毒攻击实验中被证实对毒株有治疗和预防作用^［^61-62^］。然而，该类抗体毒副作用明显，半衰期短，因此大大限制了其临床应用^［⁶³^］。基因工程技术对鼠源性的单克隆抗体进行人源化改造，即将抗体的恒定区的序列用人的序列代替构建人-鼠嵌合抗体，在一定程度上减弱了人抗鼠抗体，但仍存在一少部分鼠源成分，这直接导致抗体被迅速清除，从而降低治疗效果，其发展前景也不容乐观。

此后人源化抗体的产生减少了抗体中鼠源部分的比例，但仍有抗体可能导致抗独特型抗体的产生且存在一些局限性，例如构建方法相对复杂，操作起来费时费力；抗体的晶状体结构以及电脑模拟抗体的微细结构上都有很大的问题；降低免疫原性和保持抗原结合活性方面还有很多问题。随着单个B细胞的高通量分选技术和单细胞克隆技术的诞生，开拓了全人源抗体的研究时代。全人源的中和抗体来源于人体的外周血，具有更低的异质性，其三维空间结构与自然感染后获得的特异性抗体的空间结构更相似，从而具有不良反应小、半衰期长、疗效好的优点。

2. 全人源单克隆中和抗体国内外进展：

依据诱导产生全人源单克隆抗体的方式可以将其分为两类，一类为接种疫苗后诱导产生的抗体，另一类为自然感染诱导产生的抗体。目前接种疫苗后产生的抗体报道较少，在一项研究中，对A/Anhui/1/2013（H7N9型）候选疫苗诱导的12种H7型反应性人抗体的结合和功能特性进行了分析，结果发现中和抗体和非中和抗体都可以保护小鼠^［⁶⁴^］。相反，自然感染产生的抗体种类繁多且大部分都具备的良好的中和活性。例如，单克隆抗体Z2B3是从一名感染H7N9型AIV的儿童中分离得到，它与N9和多种N蛋白具有交叉反应性^［⁶⁵^］。有研究发现中和抗体3L11可以在小鼠暴露前和暴露后都能充分保护抵抗致命的H7N9型病毒^［⁶⁶^］。另外两种人单克隆抗体HNIgGD5和HNIgGH8均具有较高的中和活性^［⁶⁷^］。HNIgG A6和HNIgG B5这两种抗体在细胞中对H7N9型病毒也表现出较高的中和活性^［^68-70^］。3种中和保护抗体与H7血凝素复合体的晶体结构表明，它们能识别血凝素受体结合位点周围的重叠残基。其中一种抗体L4A-14与唾液酸结合位点结合，并与2016-2017年绝大多数H7N9型分离株中保存的血凝素残基接触^［⁷¹^］。此外，从2017年感染H7N9型的一名恢复期患者体内筛选出的人单克隆抗体P52E03也可对北美和欧亚血统的H7亚型病毒均表现出体外抑制（HI）和中和活性。不仅如此，它还能预防小鼠因感染致命的H7N9型病毒而导致的体重减轻和死亡，有望成为抗H7N9型感染抗病毒药物的候选药物^［⁷²^］。现阶段发现的单克隆抗体不仅可以保护小鼠免于H7N9型AIV的感染，同时又对其他型别AIV具备交叉保护作用。例如S9-1-10/5-1抗体至少能识别检测到的HA可溶性抗原的3个亚型，它能与18种HA亚型发生反应，保护小鼠免受H11pdm09、H3N2、H5N1和H7N9型病毒的致命感染^［⁷³^］。另一研究从一名急性感染H7N9型的儿童身上也分离出来一株单克隆抗体，对N1组和N2组N9型NAs均有抑制作用。此外，该抗体对高致病性H5N1型AIV的N1-NAs也具有交叉抑制作用^［⁷⁴^］。目前大量研究通过体内外攻毒实验筛选出具有中和活性的H7N9型AIV全人源单克隆中和抗体，其中部分中和抗体还具有广谱中和活性，这些抗体有望成为对抗流感病毒的新型药物。

六、小结与展望

虽然H7N9型AIV大规模疫情已经宣告结束，但是该疫情对全球带来的恐慌和影响力仍然挥之不去。迄今为止，该病毒所导致的疾病范围和感染来源信息有限。它之所以受到关注，是因为患者多病情危重。过去观点认为AIV不能直接感染人类，然而2013年3月，在我国出现了世界上首例人感染H7N9型AIV的病例，这也说明AIV已经突破了种属屏障，可以直接感染人类并导致死亡。虽迄今没有迹象表明该病毒能在人际传播，但是正是因为病毒种类的多样化导致容易发生突变，今后也许会出现人传人并产生引起流感大流行的可能性。

现有针对AIV职业暴露人群感染的相关文献主要为横断面研究，研究时间跨度短且研究的地区并非疫情地。因此未来研究应当调查更加全面的人群范围，更加广阔的研究地区，时间跨度更加长。这将有助于评估相关环境中不同亚型AIV的分布情况，掌握影响危险因素，可为将来流感病毒的预防和控制提供参考意见。考虑到在市场环境中AIV流行株的变动及新型AIV的出现，未来对于家禽养殖场和活禽交易市场中家禽及环境仍然需要保持动态监测，探索病毒变异与遗传进化规律。另一方面，对于职业暴露人群及高风险人群也需要保持病例监察系统，对其进行血清学研究以确定职业暴露人群中AIV的感染率与发病率，评估不同亚型的感染情况，掌握影响职业暴露人群的危险因素，为将来AIV的预防和控制提供参考意见。

现有流感疫苗在人群中虽然具有良好的安全性和免疫原性，但对H7N9型AIV并无交叉抗体反应^［⁷⁵^］。而目前H7N9型AIV疫苗仍然处于临床Ⅰ期和Ⅱ期试验阶段，主要目的是探索疫苗的安全性及免疫原性。暂无有效性方面数据，其在真实世界中的效力高低不得而知。因此，未来H7N9型AIV疫苗需要进行Ⅲ期临床试验以确定疫苗的效力。现有临床试验已经证明在H7N9型AIV灭活疫苗中，佐剂对疫苗免疫原性的重要性，除了铝佐剂、ASO3、MF59等当前正在使用的佐剂，其他佐剂的添加或者合并使用是否会有效地刺激机体产生更高的免疫原性也值得进一步探讨。除了传统疫苗，H7N9型疫苗中VLPs疫苗以其独特的安全性、有效性等特征，在预防H7N9型AIV方面也有着广阔的发展前景。现阶段大部分临床试验的受试者都是年龄为18~60岁的健康人群，还需要考虑该疫苗是否适用于特殊人群，例如免疫缺陷病患者或免疫功能障碍者、孕妇、低龄儿童和老年人中的免疫原性效果。除此之外，现有的H7N9疫苗接种程序一般为间隔2针次，今后还需关注如何优化免疫程序并提高免疫原性。1针次免疫接种虽然便捷，适用于暴发疫情的快速免疫需求，但是疫苗的长期保护效果会随着时间的推移而持续下降，导致保护效力的降低，而使用初免-加强策略可以诱发更持久的抗体水平。目前采用的DNA疫苗初免-灭活疫苗加强策略能提高免疫原性，但是其持久性结果还不得而知。加强免疫的剂型与剂量的选择以及加强针接种时间点和成本效益也有待进一步探讨。

一般认为，全人源单克隆中和抗体具有安全、高效的特征，可以快速中和人体内的相应病毒，使其失去致病能力，所以针对H7N9型AIV抗体的研究可以达到应急预防或针对性治疗的作用，具有广泛的应用前景。虽然目前全球范围筛选出了部分H7N9型AIV全人源单克隆中和抗体，其中部分中和抗体具有广谱中和活性，但是并没有真正投入制备被动免疫制剂的抗体，且人们对于AIV的研究也只是冰山一角，尚存大量有待研发的抗体及有待阐明的中和机制。未来对H7N9型AIV的全人源单克隆中和抗体进一步的研究不仅可有利于丰富抗体族谱又可以为AIV疫苗或靶向药物提供科学依据和理论指导。

随着疫情的逐步平息，鉴于其未来存在潜在大流行的风险，以下亟待解决的难点需要我们重点关注：监测AIV流行株的变异情况，警惕AIV流行株产生针对疫苗的免疫逃逸，对未来可能出现的AIV暴发以及联动其他流感病毒感染需要保持高度警惕并做出应对准备；对AIV疫苗的深入、持续研究亟待加强，研究安全、广谱、高效的AIV疫苗。