Nature子刊：闵玮组开发多色三维成像新技术，实现脑组织切片一次性11色成像

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生物系统本质上是由大量在三维空间相互作用的分子构成的。因此，绘制生物体内大量分子成分的三维分布图是理解复杂生物系统（比如大脑、肿瘤等）的关键。传统荧光成像方法受限于较宽的荧光光谱，通常无法同时分析多于五种组分，这被认为是“颜色壁垒”（color barrier，图1）。而现今被使用的同时对多种颜色成像的技术，包括质谱成像【1,2】和循环免疫荧光（cyclic immunofluorescence）【3,4】，基本上只适用于薄样品：质谱成像是一种表面分析技术；循环免疫荧光由于样品处理时间长、易破坏抗原表位和精细结构、高精度三维图像配准困难，这项技术只在100微米以下厚度的样品上实现过（图1）。因此，大尺度生物样品的多色三维成像一直没有真正实现。

图1. 现有成像技术受限于成像颜色和深度之间的掣肘

2021年10月4日，美国哥伦比亚大学的闵玮教授及其团队在Nature Biotechnology上发表题为Highly-multiplexed volumetric mapping with Raman dye imaging and tissue clearing的文章，开发了一种结合拉曼染料和组织透明化的多色三维成像技术（RADIANT），实现了在毫米厚度的脑组织切片中一次性成像11种分子组分，把多色成像的深度提升了10到100倍。

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研究人员首先探索了不同拉曼染料在组织透明化试剂中的成像性质。由于高浓度的组织透明化试剂在拉曼光谱的指纹区（500-1700 cm-1）有干扰信号，研究人员发现组织透明化技术不适用于传统拉曼染料的成像。为此，研究人员设计并拓展了在拉曼静默区（1800-2800 cm-1）成像的MARS染料，从中选出8种MARS染料（图2），结合4种荧光染料，用免疫标记的方法实现了在小鼠小脑薄切片上的12色成像（图2）。

 图2. 8种MARS染料的结构（a）和拉曼光谱（b），（c）小鼠小脑薄切片12色成像

然后研究人员系统地研究了针对MARS染料的组织透明化技术。研究人员之前开发了三维拉曼成像技术，但是其中基于尿素的组织透明化技术为了保存脂质结构牺牲了一定的透明化效果【5】。因此研究人员以MARS染料成像的信噪比为标准，筛选了多种现有的组织透明化技术，发现3DISCO【6】和uDISCO【7】优于其它组织透明化技术。研究人员进一步探索了uDISCO优于3DISCO的原因，发现组织透明化试剂产生的过氧化物可能使MARS染料分解，导致成像信噪比降低。利用已有的uDISCO技术，研究人员实现了在500微米厚的脑组织切片上一次性8色三维成像（图3），突破了厚样品上的“颜色壁垒”。

图3. 500微米厚度脑组织切片一次性8色三维成像

在认识到MARS染料对过氧化物敏感的基础上，研究人员进一步改进和优化了针对MARS染料的组织透明化技术。研究人员发现在低温下进行组织透明化可以提高MARS染料成像的信噪比。同时研究人员筛选了多种常见的抗氧化剂来减少过氧化物，发现在添加没食子酸丙酯后MARS染料成像的信噪比最高。最终，研究人员确定了对MARS染料成像最优的组织透明化技术，并把这种新开发的组织透明化技术命名为Raman DISCO （rDISCO）。在1毫米厚度样品上，rDISCO提供的信噪比在整个成像深度范围内都是uDISCO的2倍左右。

利用rDISCO技术，研究人员实现了1毫米厚度脑组织切片一次性11色成像（图4）。由于免疫标记和成像等步骤对所有11种分子组分一轮完成，这种一次性成像方法对深层组织三维成像有独特的优势，从根本上避免了前述循环免疫荧光技术的缺陷。比如其产生的图像本身就是三维配准的，从而不需要复杂的配准校正。与目前最好的循环免疫荧光和质谱成像相比，这个新的结果（图4）把多色成像的深度提高了10到100倍。

然后研究人员使用图像分割、空间相关分析、细胞类型组成、三维距离分析、网络分析等方法，从多色三维图像中提取系统信息。研究人员发现星形胶质细胞中的两种中间纤维蛋白—波形纤维蛋白（vimentin）和神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）—在小脑的多个区域（尤其是白质）有强相关性。通过vimentin和GFAP的表达，研究人员分割出三种不同分化程度的星形胶质细胞，发现不同种类的星形胶质细胞到血管的距离有不同的分布，暗示星形胶质细胞在分化过程中与血管相互作用的变化，并与星形胶质细胞维持血脑屏障和促进白质血管形成的功能相符合。此外，研究人员利用网络分析揭示了复杂生物系统的拓扑结构（图4）。通过计算各个蛋白在网络中的中心性（centrality），研究人员发现β-Ⅲ微管蛋白在小脑浦肯野层（Purkinje layer）中心性高，暗示β-Ⅲ微管蛋白作为浦肯野细胞（Purkinje cell）中唯一存在的β-微管蛋白亚型，对浦肯野细胞功能维持有特殊的作用（图4）。

图4. （a）1毫米厚度小脑切片11色三维成像，（b）小脑不同区域的网络图

总之，研究人员融合了拉曼显微术、染料设计和组织透明化技术上的创新，开发出一次性多色三维成像方法（RADIANT），突破了传统方法在成像颜色和深度之间的掣肘（图1）。这项技术今后还可以在成像深度、成像速度、颜色数和目标分子种类上做进一步改进。研究人员认为这项技术将在构建组织地图（tissue atlas）、表征肿瘤微环境、描绘脑神经回路等复杂生物系统研究上发挥重要作用。

哥伦比亚大学博士后施立雪和博士后魏冕为文章的共同第一作者，闵玮教授为文章的通讯作者，博士后苗宇鹏、博士生钱乃馨、石玲燕教授、博士后Ruth A. Singer和Richard K. P. Benninger教授对此项研究也有重要贡献。闵玮团队欢迎新的研究生和博士后加入其课题组。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41587-021-01041-z

参考文献

1. Angelo, M. et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nat. Med. 20, 436–442 (2014).

2. Giesen, C. et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nat. Methods 11, 417–422 (2014).

3. Gerdes, M. J. et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110, 11982–11987 (2013).

4. Lin, J.-R. et al. Highly multiplexed immunofluorescence imaging of human tissues and tumors using t-CyCIF and conventional optical microscopes. eLife 7, e31657 (2018).

5. Wei, M. et al. Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 116, 6608–6617 (2019).

6. Ertürk, A. et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7, 1983–1995 (2012).

7. Pan, C. et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat. Methods 13, 859–867 (2016).