科研资讯 | 河北农科院 | 甘薯连作对根际土壤真菌群落结构的影响

• 实验设计与样品采集

实验是从2015年开始，每年5月6日种植甘薯苗，10月7日收获，连续种植两年。我们采用随机区组设计，设置三个重复。分别在种植后30天和收获前7天采集根际土壤。样本以“S”形状采集，用取样铲将甘薯全根挖出，丢掉根表面松散的可以自然脱落的土壤，收集与根结合紧密的土壤（根际土壤）。样品过2 mm筛，并储存在-80°C下进行微生物分析。

• DNA提取，PCR扩增及数据分析
  

使用E.Z.N.A.土壤DNA试剂盒（Omega Bio-Tek，Norcross，GA，U.S.）从样品中提取微生物DNA。进行PCR扩增反应及扩增子的提取纯化。对纯化的PCR产物进行定量，按照Illumina基因组DNA文库的制备过程，利用聚合DNA产物构建了Illumina文库。在Illumina Miseq平台对扩增子文库进行双末端测序（2×250）。之后通过质量控制和筛选获得高质量的序列。以97%的相似性阈值进行聚类，对嵌合体序列进行分类和删除。使用70%的置信阈值分析每个18S rRNA基因序列的进化树。使用Mothur v.1.21.1（Schloss等人，2009年），生成包括Ace、Chao、Shannon和Coverage的丰富度和多样性指数。利用R-forge（vegan 2.0）进行了主坐标分析（PCoA）。用VennDiagram绘制韦恩图，分析处理过程中共有的和特有的OTUs。利用R中的Vegan包生成热图以分析真菌群落的组成。

• 甘薯根际土壤真菌 α- 多样性研究

利用Miseq平台对采集的样品进行高通量测序，测序结果如表1所示。所有样本的覆盖率均在99.16%以上，且每个样本的稀疏曲线已接近饱和（图1），表明测序深度已达到饱和，结果能真实反映样本条件。每个样本的reads范围为20955到37849。每个样本的OTUs范围为314到642。

随着连作年限的增加，根际土壤真菌OTU在X18和Y138采样期内总体呈上升趋势，Ace和Chao也呈上升趋势，表明X18和Y138根际土壤真菌丰富度随连作年限的增加而增加。Shannon指数也呈上升趋势，表明连作后甘薯根际土壤真菌多样性增加。值得注意的是，连作后X18的Ace、Chao和Shannon指数均高于Y138，说明X18比Y138具有更高的真菌丰富度和多样性。

• 甘薯根际土壤真菌群落组成

真菌群落结构分析表明，连作后甘薯根际土壤真菌多样性显著增加。此外，不同连作时期X18和Y138间根际土壤真菌含量差异显著。

在门水平（图2a），子囊菌、担子菌、Incertae Sedis和壶菌门在X18和Y138根际土壤中占据优势。其中子囊菌最为丰富，占84.6%，而连作后子囊菌明显减少。此外，连作对X18根际土壤中子囊菌含量的影响大于对Y138根际土壤中子囊菌含量的影响。连作2年后，X18的子囊菌含量在种植初期和收获初期分别下降了21.37%和37.77%，而Y138则分别下降了8.13%和23.28%。担子菌的含量仅次于子囊菌，且随连作时间的延长而降低，2016年初收获时略有增加。甘薯连作增加了Incertae Sedis和壶菌门的含量。芽枝霉门是一种非优势真菌。连作2年后，X18的芽枝霉门含量在种植初期和收获初期分别增加了0.40%和0.33%，Y138分别增加了0.40%和0.14%。甘薯根际土壤中也检测到纤毛虫等原生动物。在属级（图2b），X18和Y138根际土壤的优势属是黄萎病属、毛壳菌属、炭疽菌属、盖氏菌属、镰刀菌属、蜗壳菌属和Sordariales norank。

随着连作时间的延长，黄萎病、炭疽病、镰刀菌、盖氏菌呈先减少后增加的趋势。其中黄萎病、炭疽病、镰刀菌是重要的植物病原菌，对甘薯的生长有不利影响。毛壳菌对许多植物病原菌具有潜在的生物防治作用。随着连作年限的增加，毛壳菌含量逐渐降低，说明连作降低了有益微生物的含量。X18和Y138根际土壤中的Sordariales norank含量差异不显著，种植初期含量较高，收获初期含量较低。且2016年各时期的含量较2015年各时期均显著增加，其中2016年种植初期含量最高，分别占X18和Y138的32.9%和35.8%。

• 甘薯根际土壤真菌热图、韦恩图分析

如图3，在门水平，X18和Y138根际土壤真菌微生物种类较少，物种多样性较低。连作后，X18和Y138根际土壤真菌多样性增加。X18和Y138样本在每个采样周期中共有的真菌OTUs数量为86（图4）。在连作期，各采样期特有的OUT数目相对较少。在X18和Y138的4个样本中，特有OTUs的数目分别为35、22、43、99和41、12、39和78，呈现先减小后增大的趋势，这与OTUs总量的变化趋势一致。这说明连作引起了甘薯根际土壤真菌群落结构的变化。

• 甘薯根际土壤 PCoA 与真菌聚类分析

接下来我们对X18和Y138根际土壤真菌进行了PCoA分析（图5）。提取的两个主坐标解释了90.42%的变异，其中PC1解释了79.81%的变异，PC2解释了10.61%的变异。结果表明，X18样品在不同采样时间的分布是相对离散的，并且样品之间的距离较大。随着连作时间的延长，X18和Y138根际土壤真菌群落结构发生了变化。不同甘薯品种在同一采样时期的距离较近，这与聚类分析结果一致，说明同一采样时期内的真菌群落结构相似。同时，2015年的样本相近，2016年的样本相距较远，说明2015年样本真菌群落结构差异不大，而随着连作年限的增加，甘薯根际土壤真菌群落结构受到了较大的影响。

在聚类分析（图6）中，所有样本都聚类成两个主要的大组，其中相同连作年限的样本分别聚集成一个组。说明连作时间对甘薯根际土壤真菌群落有一定的影响，相同连作时间的X18和Y138根际土壤真菌群落结构相似，而不同连作年限的真菌群落结构不同。

采用 Illumina-miseq 高通量技术对连作后甘薯根际土壤真菌群落结构进行了分析。结果表明，连作后根际土壤中OTUs和Chao、Ace、Shannon指数均增加，说明甘薯连作增加了根际土壤中真菌的多样性和丰富度，这与以往有关三七和西洋参根际土壤中真菌群落结构变化的研究结果一致。此外，我们之前的研究还表明，通过磷脂脂肪酸分析，连作后甘薯根际土壤真菌含量增加。

Tan等人（2017）研究发现三七连作后根际土壤真菌优势种为子囊菌、合子菌、担子菌和壶菌门。本研究发现，X18和Y138连作后根际土壤真菌的优势类群为子囊菌和担子菌，与前人的研究结果一致。随着连作年限的增加，子囊菌的含量明显下降。子囊菌在根际土壤有机质降解中起重要作用，其含量的降低可能会影响土壤肥力。X18和Y138根际土壤的优势属有黄萎病属、毛壳菌属、炭疽菌属、盖氏菌属、镰刀菌属、蜗壳菌属和Sordariales norank。其中，毛壳菌是一种具有生物防治作用的有益真菌，甘薯连作后毛壳菌含量降低。与此相反，甘薯连作增加了炭疽菌和镰刀菌的含量，前者是引起黄萎病的一种重要植物病原菌，而后者在生产中难以控制并可能会引起甘薯根腐病等多种植物病害。根际土壤中病原真菌含量的增加会导致甘薯根腐病发病率的增加，进而促进连作障碍。这种现象将进一步形成一个恶性循环，严重影响甘薯的产量。

研究发现X18和Y138的产量在连作后显著下降，其中Y138的减产率显著高于X18。连作导致甘薯根际土壤真菌群落结构失衡，有益真菌含量降低，有害真菌或致病真菌的含量增加。因此，甘薯根际土壤微生态平衡对甘薯的健康生长至关重要。在实际生产中，可采用合理施用微生物肥料和土壤改良剂等生态手段增加土壤中有益微生物的含量，缓解连作障碍，防治甘薯根腐病。

不同甘薯品种间的根际土壤真菌群落组成也存在差异，通过聚类分析和PCoA分析发现，甘薯连作后不同采样期根际土壤真菌群落结构差异显著，但同一采样期内两个品种间差异较小。说明采样期或季节对根际土壤真菌群落结构也有一定影响。

连作障碍是由土壤-作物-微生物系统内部的复杂因素引起的，需要通过结合多种分析方法进行解决。与连作障碍有关的因素很多，如土壤酶活性、土壤理化性质和根系分泌物等等。研究表明，连作会导致根系分泌的有机酸和酚酸积累，促进病原微生物的生长，进而影响根际土壤微生物群落结构。本研究发现，甘薯连作后真菌含量发生了上述变化，但具体原因尚不清楚。可能是甘薯连作导致了根际土壤真菌生存环境的变化。例如，根系分泌物的积累使土壤pH值和有机质发生一定程度的变化，从而导致适合这种生长条件的真菌增多，不适宜的真菌减少。根际土壤微生物群落结构的变化与甘薯连作障碍密切相关。本研究为缓解甘薯连作障碍，研究甘薯连作障碍机理和对根腐病的生物防治提供了理论依据，对指导农业生产具有重要的现实意义。这也将成为甘薯研究的一个重要方面，未来的研究需要进一步研究应用微生物方法，如开发甘薯专用微生物肥料等来防治甘薯的连作障碍。因此，对甘薯连作的土壤理化性质、土壤酶活性、根系分泌物等因素及其对根际土壤微生物群落结构的影响有待进一步研究，为甘薯连作诱导的病害的防治提供更全面的依据，从而减少农药的使用，提高甘薯的品质和产量。

综上所述，连作导致甘薯根际土壤真菌多样性和丰富度显著增加，主要优势菌子囊菌门显著减少。此外，连作改变了甘薯根际土壤真菌群落结构，使有益真菌含量降低，有害真菌含量增加，从而增加了土传病害，降低了甘薯的产量和品质。此外，对于不同的甘薯品种，这些影响是不同的。因此，在实际生产中，应注意通过轮作或施用微生物肥料和土壤改良剂，保持甘薯根际土壤微生态的稳定性，以缓解连作障碍。

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