【科技前沿】专家点评：李静雅/谭敏佳/夏明锋新视角解析线粒体稳态失衡病理机制并提出NASH原始创新药物靶标

近三十年来，随着肥胖、代谢综合征、高脂血症及糖尿病等代谢异常疾病全球患病率的迅速增长，非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）作为代谢综合征的肝脏表现，也已成为全球化的重要健康问题。据2019年Hepatology杂志报道，非酒精性脂肪肝全球患病率高达25%，是慢性肝病的首要病因。我国非酒精性脂肪性肝病流行病学研究更提示我国已成为世界上非酒精性脂肪肝患病人数最多和患病人数增长最快的国家。因此，我们迫切需要寻找有效的干预治疗NAFLD的方法。然而，NAFLD以及非酒精性脂肪肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）发病机理复杂，除了倡导生活方式干预以及针对非酒精性脂肪肝病并发症药物间接治疗外，目前尚未有明确靶向与显著疗效的药物上市。

2021年10月5日，中国科学院上海药物研究所的李静雅课题组、谭敏佳课题组，联合复旦大学附属医院中山医院的高鑫/夏明锋研究团队在Cell Metabolism期刊在线发表了标题为DRAK2 aggravates nonalcoholic fatty liver disease progression through SRSF6-associated RNA alternative splicing的研究成果。研究首次揭示了死亡相关凋亡诱导蛋白激酶DRAK2通过RNA剪接因子SRSF6通路导致线粒体相关基因（包括mtDNA聚合酶POLγ2）的可变剪接异常，并且充分证明这种线粒体功能相关基因的可变剪接异常是NAFLD/NASH发生发展的关键病理生理学机制。阐明了NAFLD病理进程中的线粒体稳态失衡的新病理机制，为NAFLD/NASH提供了新的潜在干预治疗靶标。

死亡相关凋亡诱导蛋白激酶DRAK2，是细胞凋亡的正性调节因子。既往研究发现DRAK2高表达于肝癌患者的肝组织，且其表达水平与病人预后存活率密切相关【1】；研究人员通过对多种NAFLD/NASH模型小鼠以及NAFLD/NASH病人的肝脏活检组织中DRAK2蛋白表达进行检测，发现DRAK2的表达水平在NAFLD/NASH病变的肝脏组织中显著表达上调。在小鼠模型上特异性敲除/敲低肝脏DRAK2表达显著抑制NAFLD/NASH进展，而过表达肝脏DRAK2则可直接导致NAFLD/NASH病理改变，证明DRAK2在NAFLD的发生发展中发挥关键作用。

目前有关DRAK2蛋白的研究工作报道相对较少，其在慢性肝脏疾病中的生理病理机制研究仍相对空白，其下游底物及信号通路鲜有报道。基于此，研究人员分离Drak2-Flox小鼠和Drak2-HKO小鼠的肝原代细胞进行定量磷酸化修饰组学研究，鉴定差异的磷酸化修饰位点，首次揭示了DRAK2蛋白涉及的分子调控网络，意外发现前体信使RNA成熟加工以及RNA 选择性剪接相关信号通路被显著富集。磷酸组学研究提示了DRAK2介导的磷酸化修饰事件参与RNA选择性剪接生物过程。接下来，研究人员利用Co-IP-MS的蛋白质组学研究手段，通过蛋白间相互作用免疫共沉淀质谱分析，进一步确定DRAK2下游的相互作用蛋白，结果表明相互作用蛋白与pre-mRNA的选择性剪接信号通路高度相关。经过反复论证，研究人员首次揭示了DRAK2与剪接因子SRSF6之间的直接相互作用、DRAK2干扰SRSF6与上游磷酸激酶SRPK1的结合，抑制SRSF6蛋白的磷酸化水平与核定位，并最终调节其下游靶基因的RNA选择性剪接事件。

在锁定了DRAK2蛋白作用于RNA可变剪接过程之后，研究人员通过转录组学测序，对RNAseq原始数据进行RNA选择性剪接变化的外显子分析，通过数据库对选择性剪接事件发生变化的基因进行亚细胞定位，欣喜地发现其中占比20%的剪接事件与线粒体功能基因密切相关。进而，研究人员选取了mtDNA聚合酶POLγ2的编码基因Polg2进行验证，结果表明Polg2的病理剪接形式可显著降低mtDNA复制效率、损伤线粒体功能。线粒体作为三大营养物质代谢的主要场所，其稳态平衡对于细胞能量代谢及信号通路调控起决定性作用，而线粒体稳态失衡是NAFLD/NASH、肥胖等代谢性疾病的关键病理原因【2】。多项研究表明线粒体功能相关基因如Drp1, OPA1, Cpt1a等均存在多个剪接子，其活性差异与剪接型序列相关【3-5】。近年来有研究表明NAFLD/NASH病理组织中脂质合成关键转录因子SREBP1c发生病理性剪接以及RNA选择性剪接因子（如SRSF3、SRSF10等）的病理性表达，提示RNA选择性剪接在NAFLD/NASH中的关键病理作用【6-8】。而本研究的亮点在于揭示了DRAK2-SRSF6信号通路介导大量线粒体功能相关基因的选择性剪接异常，并证明线粒体基因组稳态功能基因Polg2的病理性剪接直接诱发线粒体功能损伤，阐明DRAK2-SRSF6介导的RNA可变剪接异常是NAFLD/NASH重要病理分子机制。

最后，研究人员利用已报道的DRAK2小分子抑制剂22b探究其对NAFLD/NASH的治疗作用。结果发现，22b能够影响DRAK2-SRSF6信号通路，纠正RNA可变剪接异常改善营养诱导的线粒体功能损伤与肝脂肪变性，进而缓解NAFLD/NASH的病理进程。该药理性干预研究进一步论证了NAFLD/NASH病理进程中DRAK2-SRSF6这一全新分子机制，并提示其作为新靶向策略干预非酒精性脂肪肝病的可行性。

综上，该项研究首次发现NAFLD/NASH病理进程中线粒体功能相关蛋白的RNA选择性剪接失调，揭示了非酒精性脂肪肝病理形成中的线粒体稳态失衡新分子机制，为NASH的创新药物研发提供原始创新的药物靶标以及可能的干预手段，具有重要的转化价值与临床意义。

图1. DRAK2-SRSF6介导非酒精性脂肪肝炎的分子机制

本课题由中国科学院上海药物研究所李静雅研究团队及谭敏佳研究团队联合上海复旦大学附属医院中山医院内分泌科高鑫/夏明锋研究团队，精诚合作、共同完成。上海药物研究所博士研究生李玉峰、副研究员徐骏宇、博士后卢玉婷和复旦大学附属医院中山医院内分泌科卞华主任医师，为本文共同第一作者。华东师范大学汤杰教授、杨帆教授和上海交通大学李婧教授为本研究做出重要贡献。该工作得到上海药物研究所李佳研究员、徐华强研究员、谢岑研究员、美国密歇根大学的芮良优教授和墨尔本皇家理工大学叶冀明教授的支持。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cmet.2021.09.008

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）及其严重类型非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis, NASH）是指除外过量饮酒或其他明确肝损因素所导致的以肝细胞脂肪过度沉积为特征的临床病理综合征。目前，NAFLD已成为全球慢性肝病的首要病因，累及四分之一的成人，对人类健康造成重大威胁。近年来，国际知名肝病专家组联合倡议将NAFLD更名为代谢相关脂肪性肝病（metabolic associated fatty liver disease, MAFLD），更加突出了代谢功能障碍在导致肝细胞脂肪沉积中的核心地位，同时也向临床医生、新药研发机构和公众传递一种重要信息，即代谢功能障碍、超重/肥胖、2型糖尿病是这类肝脏疾病发生和发展的关键所在。

NAFLD发病机理复杂，迄今在NASH治疗药物研发领域，美国FDA主要聚焦肝脏炎症损伤的改善以及肝纤维化的逆转。然而，NASH新药研发的治疗效果和安全性不尽如人意。而与之对应的是，部分靶向肥胖和代谢异常的药物（如吡咯列酮、胰高糖素样肽1受体激动剂、钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂）却在改善NASH甚至逆转纤维化方面显示了良好的治疗效果。

线粒体是肝细胞内能量代谢的重要细胞器，是长链脂肪酸进行氧化代谢的主要场所。线粒体稳态平衡对于肝细胞能量代谢及信号通路调控起决定性作用。靶向线粒体能量代谢的药物在多种代谢异常疾病治疗方面显示了巨大的潜力，但目前在NAFLD治疗方面仍研究较少。

近日，来自中国科学院上海药物研究所的李静雅课题组和谭敏佳课题组以及复旦大学附属中山医院高鑫、夏明锋研究团队合作在国际知名期刊Cell Metabolism上发表题为DRAK2 aggravates nonalcoholic fatty liver disease progression through SRSF6-associated RNA alternative splicing的研究论文。该研究发现死亡相关凋亡诱导蛋白激酶DRAK2在NAFLD/NASH患者和小鼠肝脏组织中高表达， 并且DRAK2可通过SRSF6通路调节线粒体功能相关基因的RNA可变剪接，造成线粒体功能损伤及NAFLD的发生和进展。DRAK2小分子抑制剂22b则可有效逆转高脂高果糖负荷所致肝细胞线粒体功能损伤，从而缓解NAFLD的病理进展。

由于既往有关DRAK2蛋白的研究报道较少，其在外周代谢组织中的生理功能与病理机制至今仍是空白，其下游底物及信号通路更是鲜有报道。研究人员巧妙借助了定量磷酸化修饰组学、转录组学研究方法和蛋白相互作用-免疫共沉淀-质谱技术手段（Co-IP-MS），揭示pre-mRNA加工成熟过程的调节通路与RNA剪接复合物被显著富集到DRAK2相关的分子调控网络。机制研究显示DRAK2与RNA剪接因子SRSF6蛋白直接相互作用，竞争性结合并抑制其被上游磷酸激酶SRPK1作用，进而影响SRSF6蛋白的磷酸化水平，阻滞其入核并实现对下游靶基因的RNA选择性剪接调节，其中包括对线粒体DNA聚合酶POLγ2的编码基因Polg2的可变剪接，最终影响线粒体DNA复制效率，损伤线粒体功能。利用已报道的DRAK2小分子抑制剂22b可有效阻断 DRAK2-SRSF6之间的相互作用，促进SRSF6的磷酸化并转运入核，减少POLγ2的病理性剪接形式Polg2-exon2+的产生，逆转肝细胞内高脂负荷引起的线粒体功能损伤。

总之，该研究以DRAK2蛋白为切入点，创新性地将线粒体功能相关蛋白基因选择性剪接失调与NAFLD病理进程联系在一起，揭示了NAFLD 病理形成中的肝脏线粒体稳态失衡以及新分子调节模式，为NAFLD/NASH的创新药物研发提供原始创新的药物靶标以及干预手段。

线粒体作为细胞进行有氧呼吸的主要场所，为大多数细胞的生命活动提供能量，被称为细胞的“能量工厂”。线粒体作为半自主性亚细胞器，拥有独立的遗传物质。线粒体功能蛋白由核基因和线粒体基因组共同编码，其中核基因编码数千种参与线粒体功能发挥的蛋白，线粒体基因组编码2个rRNA，13个电子传递链复合物蛋白以及22个tRNA。线粒体基因组的遗传性突变导致线粒体功能紊乱，造成器官功能障碍及线粒体疾病，如Leber’s视神经病变、耳聋等。

线粒体基因组DNA的复制与转录、翻译过程依赖于许多核编码蛋白。DNA聚合酶POLγ是核编码的线粒体DNA聚合酶，主要负责线粒体DNA的复制，由一个140 kDa的催化亚基POLγ1以及两个55 kDa的辅助亚基POLγ2组成，其中Polg2是辅助亚基POLγ2的编码基因。既往研究表明报道POLγ基因存在多个突变位点，其位点突变直接影响线粒体DNA的复制过程与拷贝数并最终导致线粒体功能的损伤。因此，遗传性POLγ突变与线粒体功能及疾病发生发展密切相关。然而，非遗传因素所致POLγ病理性改变及调控机制未曾报道。

近日，中国科学院上海药物研究所李静雅课题组和谭敏佳课题组，联合复旦大学附属医院中山医院的高鑫、夏明锋研究团队在Cell Metabolism杂志上发表题为DRAK2 aggravates nonalcoholic fatty liver disease progression through SRSF6-associated RNA alternative splicing的研究论文。该研究发现营养诱导非酒精性脂肪肝小鼠肝组织中产生线粒体DNA聚合酶POLγ2的病理性剪接子Polg2-exon2+，Polg2-exon2+显著抑制线粒体DNA的复制与转录以及肝细胞的线粒体氧化呼吸能力。研究人员发现死亡相关凋亡诱导蛋白激酶（DRAK2）在NAFLD/NASH患者的肝穿病理组织及模型小鼠肝组织中高表达，且DRAK2竞争性结合剪接因子SRSF6，从而介导RNA可变剪接影响线粒体DNA聚合酶POLγ2的病理性剪接，最终促进NAFLD/NASH的发生发展。这项研究揭示了NAFLD/NASH病理进程中mtDNA拷贝数下降以及线粒体功能受损的全新调控机制。

长期以来，人们对非酒精性脂肪肝组织内线粒体功能紊乱的认识，大多基于脂质过度负荷引起的氧化应激损伤以及细胞内信号通路紊乱所致线粒体稳态失衡。本项研究通过对NASH小鼠肝组织的转录组测序，发现逾百个线粒体功能相关基因的可变剪接事件，其中就包含了POLγ2的病理性剪接Polg2-exon2+。作者构建了Polg2的不同剪接子质粒转染肝细胞，考察不同剪接形式Polg2对mtDNA的复制及线粒体功能的影响，发现病理性剪接子Polg2-exon2+显著抑制mtDNA拷贝数并损伤线粒体氧化呼吸功能。研究提示营养诱导的核编码基因POLγ病理性改变直接参与非酒精性脂肪肝病的发生发展。

中国科学院上海药物研究所李静雅研究团队，致力于探索代谢性疾病中的线粒体稳态失衡分子机制。研究人员发现DRAK2在NAFLD/NASH模型小鼠以及NAFLD/NASH患者的肝穿刺组织中，表达均显著升高，且与NASH病理评分呈正相关。为探究DRAK2在NAFLD/NASH病理进程中的功能，研究人员采用AAV病毒构建肝脏DRAK2高表达与敲低小鼠，以及DRAK2肝脏特异性敲除小鼠（Drak2-HKO）等多种技术手段，揭示DRAK2蛋白调控线粒体功能并介导NAFLD/NASH病理进程。分子机制方面，基于磷酸化修饰组学研究和蛋白相互作用质谱组学研究等多维度分析，阐明DRAK2通过RNA剪接因子SRSF6调节线粒体功能相关基因的RNA选择性剪接，抑制线粒体生物合成与功能、促进NAFLD/NASH病理进程。

该研究围绕DRAK2的表型探索，聚焦RNA选择性剪接与线粒体功能，首次阐明营养与环境条件下DRAK2-SRSF6通路调控Polg2基因可变剪接、影响mtDNA的复制及线粒体功能，揭示NAFLD/NASH病理进程中线粒体稳态失衡的全新调控机制。该研究创新性地揭示了NAFLD 病理形成中mtDNA复制障碍新调节模式，为线粒体相关疾病创新药物研发提供靶向策略以及可能的干预手段。

图2. Polg2病理性剪接子影响mtDNA复制及线粒体功能

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