一种功能食品增强顺铂抗肿瘤疗效研究

文章来源:余亚英,张杰,陈哲文,张月明,缪明永,石汉平.一种功能食品增强顺铂抗肿瘤疗效研究[J].肿瘤代谢与营养电子杂志,2021,8(9):380-386.

正 文

2019年国家癌症中心发布的全国癌症统计数据显示，恶性肿瘤患者 5年相对生存率达到 40%，较十几年前的30%有了很大改善，但与西方发达国家（60%~70%）仍有很大差距，其原因是多方面的，但是不重视肿瘤患者营养可能是一个最重要原因。中国抗癌协会肿瘤营养专业委员会组织的“肿瘤患者营养状况与临床结局”全国多中心调查结果显示，恶性 肿 瘤 患 者 中 度 和 重 度 营 养 不 良 发 生 率 高 达57.88%［1］，同时有研究发现10%~20%的癌症患者直接死于营养不良，而不是肿瘤本身［2］。肿瘤患者的营养不良可导致临床结局恶化，住院时间延长，生存时间缩短，资源消耗增加，医疗费用升高等［3⁃5］。因此，近年来肿瘤患者营养问题开始受到重视，提出了营养治疗是肿瘤的一线治疗［6］。根据肿瘤患者和肿瘤代谢特点进行合理设计和开发一类适合肿瘤患者的配方功能食品，如高热量、高蛋白、高脂和低碳水化合，以及富含维生素和微量元素为特点的医疗膳食和特殊医学用途配方食品（food for special medicalpurposes，FSMP）的临床应用不断增加［7］。不同膳食或FSMP的营养成分或植物活性分子比例不同，因而对细胞的代谢和功能产生很大的影响，而不同代谢特征的细胞如肿瘤细胞会产生不同影响（能量应激或氧化应激等）［8⁃10］。因此，营养治疗不仅改善营养状况，而且可以直接或间接杀伤肿瘤细胞，提高临床治疗效果等［11, 12］。

该功能食品（五神天然全息营养粉）是一种由55种天然动植物食材加工成的全营养配方食品，其成分分析发现该配方食品有175种以上生物活性分子，具有抗氧化、调节免疫和抗炎等方面作用，同时具有高能量、高蛋白和高脂的组成特点，非常符合肿瘤患者的营养需求。前期研究发现，该功能食品在S180荷瘤小鼠模型中具有一定的抗肿瘤作用，但是机制尚不明确［13］。为此，本研究选择有免疫力的C57BL/6小鼠，构建肺癌Lewis皮下移植瘤模型进行这种功能食品的干预研究，同时观察与抗癌药物顺铂合用的治疗效果，进一步探讨其抗肿瘤作用及可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 荷瘤鼠模型建立及分组 鼠源性肺癌 Lewis 细胞用 Dulbecco′s 改良培养基（Dulbecco modified eaglemedium,DMEM）（含 10% 胎牛血清和 100 U/ml 的青链霉素，美国 Gibco 公司）培养于 5%CO2、37 ℃培养箱中，隔天换培养液，胰蛋白酶消化传代。雄性4周龄C57BL/6黑鼠购买并饲养于徐州医科大学实验动物中心。小鼠适应性生长 1 周后，取对数生长期的细胞，用 PBS 调整 Lewis 细胞浓度为 1×107/ml，于小鼠的右后支背部皮下接种细胞悬液200 μl。14 d左右长出移植瘤，用游标卡尺测量肿瘤直径，按照V＝ab2π/6（a为最大直径，b为最小直径）计算肿瘤体积。待移植瘤长至约 200 mm3随机分为对照组、功能食品（五神）组、顺铂组和功能食品顺铂组四组、根据样本量选择的相关文献报道[14]，最终各组小鼠样本量确定为8只。顺铂组与功能食品顺铂组腹腔注射顺铂 4 mg/kg 体重，隔天给药，对照组与功能食品组注射等体积生理盐水，实验过程中每周测量小鼠体重及移植瘤体积，至实验终点用皮尺测量小鼠后肢肌围（以最粗部位为准）；眼球取血：静置 30 min后，在 4 ℃下以 3000 r/min 离心 10 min，常规分离血清，取上层血清放-80 ℃冰箱冷藏备用；取组织：冰袋上迅速取出瘤组织、脾脏等组织器官，用冰生理盐水冲洗，吸去血液，修去脂肪、系膜，用滤纸吸干水分，用电子天平称其湿重，分别加入生理盐水或多聚甲醛固定液，备用。

这种功能食品由55种天然食材组成，富含抗氧化、抗炎、调节免疫等 175种以上活性物质，包括粗多糖、原花青素、花青素、白藜芦醇、角鲨烯、维生素C、硒、多酚和牛磺酸等，其蛋白质、脂肪、碳水化合物 、纤 维 比 例 分 别 为 22.1%、12.7%、36.36% 和21.7%，经喷雾干燥、微波处理、低温烘烤等特殊制造工艺生产而得，符合国家食品质量安全标准。1.2 小 鼠 血 清 白 蛋 白 利 用 全 自 动 生 化 分 析 仪（C501，罗氏）检测小鼠血清白蛋白水平。

1.3免疫细胞功能检测 通过流式细胞仪检测相关免疫细胞亚型。实验终点收集小鼠新鲜脾脏及移植瘤样本，采用培养法制备单细胞悬液，调整浓度为1×106/ml,在制备过程中，用荧光标记抗体标记上述单细胞悬液中的细胞（标记抗体购自 BD Biosciences 公司或 Bio⁃legend公司），采用流式细胞术（流式细胞仪）检测相关细胞亚型，并计算不同细胞亚群的百分比。

1.4 细胞因子检测 小鼠血清 IL⁃6 和 IL-10 ELISA 检测试剂盒均购自 R&D 公司，按照试剂盒操作步骤,用酶标仪检测血清样品及标准品 450 nm（矫正波长540 nm）处的 OD 值，绘制出标准曲线，计算各组样本的IL⁃6和IL⁃10浓度。

1.5 免疫组织化学检测瘤组织中微血管形成情况（CD31 染色） 移植瘤组织用 4% 多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、切片后进免疫组织化学染色。一抗为CD31 抗体（Abcam），稀释浓度为 1∶50；二抗为 HRP标记山羊抗兔抗体，工作浓度 1∶200。磷酸盐缓冲液切片作为阴性对照。DAB显色。

1.6 统计学分析 使用SPSS 22.0及Graphpad prism 7进行统计分析及作图，计量资料以（均数±标准差）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Dunnet t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.3免疫细胞亚群和细胞因子

上述结果提示该功能食品配合顺铂治疗能明显细胞免疫功能，这可能与其增加抗肿瘤效果密切相关。

2.3.2 荷瘤小鼠肿瘤和脾脏中分泌细胞因子细胞的比例 方差分析显示，各组荷瘤小鼠肿瘤和脾脏中分泌细胞因子细胞的比例差异有统计学意义。与对照组相比，功能食品组小鼠脾脏中CD8+GramB+明显升高（P<0.01），顺铂组小鼠脾脏中的CD8+IFN⁃γ+、CD8+GramB+、CD8+perforin+T 细胞明显升高，差异有统 计 学 意 义 ；与 顺 铂 组 相 比 ，功 能 食 品 顺 铂 组CD8+IFN⁃γ+、CD8+perforin+T 细胞和 IL⁃10+T 细胞比例均明显降低，统计学分析差异显著。而肿瘤组织中 ，与 对 照 组 相 比 ，功 能 食 品 顺 铂 组 小 鼠CD8+IFN⁃γ+、CD8+GramB+明显高于对照组升高，余各组间差异无统计学意义。

2.4 血清细胞因子 方差分析显示，各组小鼠血清中IL⁃6与IL⁃10含量差异无统计学意义。

3 讨论

肿瘤患者营养不良发生率非常高，根据患者的年龄、肿瘤类型和分期不同，营养不良的发生率在20%~70%［15, 16］。营养不良带来一系列不良后果，包括并发症增多、不耐受放化疗、预后差等［3, 17］。因此，对于肿瘤患者加强营养干预具有重要临床意义。肿瘤营养学是一门比较年轻的学科，旨在通过营养教育和营养干预（膳食和特殊医学用途配方食品）来改善人体营养状况、提高人体免疫力，降低炎症等作用［18, 19］。食物中的许多天然活性物质已被证明能够促进人体健康，通过合理的搭配起到协同有益的作用［20⁃22］。该功能食品是由 55 种天然食材按一定比例组成的营养配方食品，成分分析显示该配方食品特点：营养均衡，高能量、高蛋白、高脂肪/碳水化合物比，同时富含增强免疫、抑制炎症和抗氧化等活性物质。这些特点的配方食品有助于改善肿瘤患者营养状况和提高免疫功能，因而有助于提高抗肿瘤的疗效［23, 24］。

近年来，肿瘤免疫微环境的概念逐渐被人们所熟知。其中，CD4+T细胞在适应性免疫应答中处于中心地位，它能够通过直接杀伤肿瘤靶细胞、活化其他效应细胞、参与肿瘤免疫记忆等多种途径促进抗肿瘤免疫。CD8+T细胞在识别和清除肿瘤过程中发挥着十分重要的作用，它的数量直接决定了对抗肿瘤的杀伤能力［25］；此外，NK细胞，又称自然杀伤细胞，同样是机体重要的免疫细胞，它具有广谱抗肿瘤细胞的作用，可通过非特异性免疫应答直接杀伤肿瘤细胞，是抗肿瘤的第一线细胞，能够迅速溶解某些早期肿瘤［26, 27］。本研究通过检测不同细胞亚型的比例，重点分析TIME肿瘤免疫微环境与该功能食品抗肿瘤疗效的相关性。

研究结果显示，该功能食品干预一定程度上抑制荷瘤小鼠的 Lewis 肺癌生长，与顺铂联合时能显著增强顺铂抗肿瘤疗效。同时，该功能食品干预的荷瘤小鼠后肢肌围和血浆白蛋白水平明显高于对照组；小鼠脾脏及瘤组织中免疫细胞亚群分析显示，功能食品顺铂组荷瘤小鼠免疫效应细胞亚群CD3+、CD4+T 细胞，CD3+、CD8+T 细胞，NK 细胞的比例 明 显 增 高 ，CD8+IFN⁃γ+ 、CD8+Perforin+T 细 胞 和IL⁃10+T 细胞比例均明显降低，脾脏中抑制性免疫细胞亚群 MDSCs 和 Treg 细胞及肿瘤组织中的 Treg 细胞有一定程度降低。该结果表明，该功能食品增强顺铂抗肿瘤疗效可能是通过调节免疫细胞亚群和改善营养状况密切相关。

综上，本研究初步证实该功能食品能够改善荷瘤小鼠的一般营养状况，增强免疫功能，并增强顺铂的抗肿瘤疗效，这表明该功能食品可作为抗肿瘤的重要潜在辅助治疗手段。