刘国霞博士等利用临近蛋白标记蛋白质组学揭示在应激反应过程中电压门钙通道的分子机制

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原标题：Nature：刘国霞博士等利用临近蛋白标记蛋白质组学揭示在应激反应过程中电压门钙通道的分子机制

在应激反应中，肾上腺素上升导致心率加快，心脏收缩力上升， 从而达到心脏供血到全身组织的目的。这个过程中，钙离子通道对于调节心脏的收缩起到关键作用。那么钙离子是如何调节的？1983年瑞典的伯尔尼大学药学系Harald Reuter课题组在Nature杂志上发表了文章，首次描述了钙离子通道激活活性，发现在培养的大鼠新生心肌细胞中，8-溴腺苷-3',5'-环单磷酸和异丙肾上腺素都会使钙通道活性增加，以此得出可能蛋白激酶A(PKA)磷酸化钙通道亚基或与其相关的蛋白，从而激活钙通道。

在过去的三十多年中， 许多研究小组都致力于寻找PKA是如何调节钙离子通道的活性，PKA在钙通道上的磷酸化位点是什么。 钙离子通道由α亚基和β亚基形成，最早Ser1928被认定是PKA调控的唯一位点，但是在2000年早期，一些研究证实这个位点并不重要。同样，哥伦比亚大学Steven O. Marx的实验室的杨林博士主导的研究发现Ser1700和Thr1704位点也不重要，其它在β亚基上的几个位点也被几个实验室证实并不重要。

几年前, Marx实验室由杨林博士在PNAS发表文章，把α亚基上所有的保守的可能的PKA磷酸化位点突变以后，做转基因小鼠，这个突变基因在小鼠的心肌细胞还是可以被调节。另外，杨林博士的一篇JCI文章发现，如果把不能结合β亚基的α亚基基因转到小鼠里，那么这只小鼠的心肌细胞里的突变钙离子通道就不会被肾上腺素调节，杨博士和实验室其他的研究人员把所有的在α亚基和β亚基可能的磷酸化位点突变掉，实验发现这样的转基因小鼠的心肌细胞还是可以被调控，这些结果说明PKA磷酸化钙通道对肾上腺素的调控通路并不是至关重要的因素。

那么这个通路中缺了什么？更至关重要的是，在体外过表达系统中，人们迄今为止并不能重建钙离子调节通路，为什么? 2020年1月22日，哥伦比亚大学Steven O. Marx博士课题组刘国霞博士主导，和其它课题组成员一起在Nature上发表文章Mechanism of adrenergic CaV1.2 stimulation revealed by proximity proteomics，利用临近蛋白标记蛋白质组学技术揭示了钙离子通道调控的分子机制。

该研究基于Alice Ting博士创新的方法，用改造的抗坏血酸过氧化物酶（APEX2）作为标记工具，将该酶链接到要研究的核心蛋白上，在生物素酚(biotin phenol)和过氧化氢的存在下，在活细胞中APEX2可以把生物素biotin标记到核心蛋白半径20nm以内的所有可标记的蛋白上。这些蛋白可以和被连接到磁珠上的抗生物素蛋白StraptAvidin结合而得到纯化，再利用定量蛋白质组学，鉴定核心蛋白周围的蛋白质谱的信息。

刘博士做了两个转基因小鼠模型，一个模型是apex2-α1c, 是把APEX2接到钙通道α亚基n末端，同时把α 亚基的尼索地平敏感位点突变掉，用以区分体内钙通道和转基因钙通道在心肌细胞中的功能，已确定该转基因在体内功能不受抗APEX2的影响；一个模型是apex2-β2b，是把抗坏血酸过氧化物酶接到钙通道β亚基的n末端。当确认这两个转基因小鼠的蛋白质能正常的合成和运输到心肌细胞t-tubules上，功能一切正常后，分离这两株小鼠的心肌细胞，然后用生物素标记， 经过抗生物素蛋白纯化后，在哈佛大学Steven P. Gygi博士领导的蛋白质组学中心的Marian Kalocsay博士的帮助下对多个样品利用定量蛋白质组学技术同时进行鉴别，发现apex2-α1c小鼠的心肌细胞和apex2-β2b小鼠的心肌细胞经过异丙肾上腺素处理后，和对照组心肌细胞比，属于small Ras-like G protein 家族的Rad蛋白量在标记纯化过的样品里明显降低了，而在正常的C57细胞中，异丙肾上腺素处理过的心肌细胞和对照组心肌细胞Rad(Rrad)蛋白总量并没有明显改变。说明经过药物处理后的钙通道附近的Rad蛋白远离了。

Rad蛋白在1993年被发现，至2000年早期的研究发现它的家族蛋白都是钙通道的抑制蛋白，研究人员推测PKA的磷酸化Rad蛋白肯能影响其与钙通道的结合，从而影响它抑制钙蛋白活性，而这个Rad蛋白就是长期要寻找的蛋白 。研究人员要用膜片钳技术通过体外过表达系统重建钙通道的调节功能，来证明这一推测。 考虑到Rad超强的抑制活性，研究人员调整了两个条件，一个是采取了穿孔的膜片钳（perforated patch clamp）技术， 从而有效的保持了细胞内微环境尽可能不受打扰；第二个条件就是调整了钙蛋白和Rad蛋白的比率， 研究人员把Rad基因量相对降低， 调整之后通过纪录钙通道的活性，研究人员惊喜地发现，当细胞里加入腺甘酸环化酶激活剂forskolin后（注意这里不用异丙肾上腺素是因为 HEK细胞里没有肾上腺素受体，所以不能通过肾上腺素受体激活腺甘酸环化酶，从而激活PKA)， 钙通道活性提高了, 最高可提高4.5倍，平均提高了1.5倍，而且提高的倍数和电流的大小成反比，这些特性和分离的心肌细胞中钙通道的表现相同。

那么PKA是如何通过Rad调节钙通道活性的呢？在哈佛大学合作者Marian 和Gygi博士的帮助下，通过蛋白质质谱测定，发现了Rad蛋白的几个磷酸化位点，当把这几个位点突变后，发现突变后的 S4A蛋白在HEK细胞里不再具有调节钙通道活性的功能；单通道电生理纪录技术（single channel recording）也证实了这一实验结果。进一步实验表明，272和300位的丝氨酸是关键的pka磷酸化靶位点。 利用流式细胞荧光能量共振转移分析技术(Flow Cytometric FRET two-hybrid assay)的研究表明， Rad蛋白是通过结合钙通道的β亚基来实现其对钙通道的调节作用。

为了探索这种调节是广泛的还是特殊的，研究人员检测了Rad对神经细胞钙通道CaV2.2和在嗜铬细胞表达的钙通道CaV1.3的作用，发现Rad蛋白对这两个蛋白的功能也有调节作用，另一个和Rad同属一个家族的蛋白Gem和CaV2.2同时表达, 发现gem蛋白和Rad一样可以调节CaV2.2的活性。

总而言之，该研究第一次利用邻近蛋白标记蛋白质组学的方法，找到了长久以来人们一直寻找的钙离子通道的调控蛋白Rad，PKA磷酸化Rad，使其从钙通道脱离，从而减少了对钙通道的抑制，从而提高了钙通道的活性，该研究有助于了解心律不齐和心衰等疾病。

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https://doi.org/10.1038/s41586-020-1947-z