NSMB背靠背 | 杨薇等揭示RAG重组酶切割双链DNA和抑制切割后基因转座
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RAG1-RAG2（RAG）重组酶通过识别与切割V、D和J片段两侧的重组信号序列 (Recombination signal sequence，RSS）来启动V(D)J基因重排。为了切割DNA双链，RAG要进行两步反应，首先在top链上水解产生一个切刻，从而暴露一个3’羟基用于第二步发卡形成反应中对bottom链的攻击，最后在RSS端形成一个DNA平末端和在抗体基因片段端产生一个DNA发卡，但是对于RAG是怎么利用一个活性中心来先后特异性地切割DNA双链的分子机制还尚不清楚。RAG是V(D)J基因重排过程中不可或缺的DNA重组酶，但同时RAG也属于RNH家族DNA转座酶。体外试验证明，RAG像其它经典DNA转座酶，会将切割后的RSS序列插入到富含GC的目标DNA中，从而完成RSS的转座，而在体内，这种转座现象非常少见，这就保证了RAG在V（D）J重排的过程中不会对基因组完整性形成威胁。那么RAG是怎么减少DNA转座和保证正常基因的完整性的呢？
2020年2月3日，NSMB 在线发表了美国国立卫生研究院消化道、糖尿病和肾病研究所杨薇课题组与Martin Gellert课题组的研究成果：“Cutting antiparallel DNA strands in a single active site”和“How mouse RAG recombinase avoids DNA transposition”，他们报道了RAG参与DNA双链切割和DNA转座的复合物的冷冻电镜结构，并揭示了RAG参与V（D）J重排过程中DNA切割的分子机制以及解释了RAG重组酶是怎么降低DNA转座反应。
RAG切割DNA双链过程中，首先， RAG会结合含抗体基因的RSS序列，形成预反应复合物（Pre-reaction complex，PRC），PRC状态下，被切割的top链磷酸基离活性中心有20 Å的距离，只有不该被切割的bottom链离活性中较近，但PRC整体的open构象使得活性中心无法被完全装配，只有一个金属离子被螯合，确保bottom链不被误切。通过RAG和DNA同时发生构象变化，复合物会从PRC态会变成切刻发生态（Nick-forming complex， NFC），这一步转变具有温度依赖性，只有在37℃才能检测到切刻反应的发生，而在室温22℃基本检测不到切刻的发生。结构显示，在PRC到NFC的转变过程中，DNA会在温度的影响下在RSS的7-mer的第2和第3对碱基对（CACAGTG）处发生解旋和氢键断裂，并在双链中间形成具有链间碱基堆积作用的拉链状“TAGC” 结构（碱基TG来自于bottom链，碱基AC来自于top链），DNA整体被拉长6 Å和被扭转180˚，而RAG则通过收紧RAG1上的ZnH2结构域来进一步稳定被拉伸的“拉链”结构，同时NFC的活性中心得以完全装配，从而确保了RAG的第一步反应—对top链的切割。对于其第二步反应，复合物需要发生一个整体性的构象变化，形成发卡发生态（Hairpin-forming complex， HFC），RAG通过进一步收紧两侧的RAG1-RAG2异源二聚体， DNA的top链被挤出活性中心，而bottom链则被对向RAG1挤入活性中心， top链的3’羟基再亲核攻击bottom链的磷酸在抗体基因端形成发卡，从而完成DNA的双链切割。
RAG切割双链DNA过程中两步关键反应的整体构象变化。左图为PRC-NFC转变，有图为NFC-HFC转变。
目前人们对于RAG在体内是怎么降低DNA转座的分子机制知之甚少，研究人员通过解析了的3.1 Å 的RAG的转座中间态复合物（Strand transfer complex，STC）结构，发现转座过程中目标DNA会在目标序列（C^GCC^G）的第2和第4碱基对两侧发生两个>80°的弯曲和扭转，从而让DNA大沟拉大至～30 Å，这种大角度的弯曲和扭转在其它经典DNA转座酶中非常少见，从结构上解释了RAG的转座反应不容易发生。另外，RSS对目标DNA的整合位点与弯曲拐点相差1 bp，从而使得逆转座反应（Disintegration）能够发生，其分子机制与RAG切割DNA的第二步反应-发卡的形成相似，逆转座会将转座中间态DNA还原成RSS和目标DNA，这在其它经典DNA转座酶中也非常少见。研究人员提出，在进化过程中，RAG2的出现促进了RAG在V（D）J过程中对抗体基因的切割，同时抑制其DNA切割后的转座反应，使RAG成为一个高效的重组酶。
RAG催化发卡形成反应和逆转座反应的相似性
原文链接：
https://doi.org/10.1038/s41594-019-0363-2
https://doi.org/10.1038/s41594-019-0366-z