没有抗体，如何进行 SARS-CoV-2 的体内原位研究？

随着 SARS-CoV-2 冠状病毒疫情的日益严峻，人们对这一新型冠状病毒也在进一步研究中。目前，已经确认 SARS-CoV-2 病毒的序列，也了解到该病毒与 SARS 病毒感染机制相同，都是通过人细胞的 ACE2 蛋白结合，从而引发感染。

而这一病毒进入细胞内之后的一系列生物学反应，对人体其他组织器官的易感性，乃至治疗方法的选择都有待进一步研究。那么，现阶段抗体获取困难的情况下，如何开展进一步的研究工作呢？

事实上，RNAscope 技术作为病毒生物学研究的利器，在过去的若干年内一直在病毒领域广泛使用。该技术在 DNA 病毒、RNA 病毒以及逆转录病毒等诸多病毒研究领域均贡献了大量原位信息，尤其可以提供病毒在不同组织器官中的：

在病毒定位研究中，2015 年巴西寨卡病毒（Zika）爆发时，华盛顿医科大学 Jonathan J. Miner 为首的研究团队即通过 RNAscope 方法检测到寨卡病毒在视网膜，视神经和角膜中的分布，直观给出了该病毒在眼内的分布图（见下图，病毒阳性信号为图中的棕色信号点）^[1]。

在对寨卡（Zika）病毒疫苗的研究中，美国 Vanderbilt University 的 Gopal 研究团队发现人的单克隆抗体 ZIKV-117 可以有效减低小鼠感染 Zika 后组织的病理特点，并通过 RNAscope 检测试剂盒检测了注射安慰剂，同型对照小鼠抗体以及 ZIKV-117 抗体的怀孕小鼠胎盘内病毒的分布和数量，从而证实了疫苗的效果（见下图，病毒为图中的棕色信号点）^[2]。

中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）是又一种近年来高致病性的冠状病毒。在对该病毒疫苗的研发过程中，Haaqmans BL 研究团队通过 RNAscope 技术检测了注射疫苗的效果，发现骆驼鼻粘膜内，病毒颗粒在疫苗注射组相较于对照组有显著下调（见下图，RNAscope 阳性信号为 A 图，B 图和 C 图 ISH 中的红色信号点）^[3]。

在病毒感染动物模型的建立和验证中，Drexler JF 团队通过 RNAscope 的方法，检测小鼠肝细胞内 HCV 病毒的存在和分布状况，确认 HCV 病毒感染动物模型建立成功（下图中的红色信号点）^[4]。

相同的 RNAscope 应用实例也被报道在汉他病毒（Sin Nombre/Hantavirus，SNV）感染病毒动物模型中。RNAscope 结果确认汉他病毒存在于恒河猴肺脏上皮细胞内（下图中棕色信号点）^[5]。

在病毒入侵感染动物或人之后，免疫系统对于病毒的应激反应随着病毒的差异而不同。例如在塞尼卡谷病毒（Seneca Valley Virus，SVV）感染的恒河猴体内，人们发现该病毒诱导短暂的 CD8 阳性 T 细胞在恒河猴的神经节浸润。RNAscope 检测结果显示感染过 SVV 之后，伴随着 CD8 阳性 T 细胞的聚集，同一区域表达 CXCL10 细胞趋化因子，提示 T 细胞的聚集是由 CXCL10 因子诱导引发的^[4]。

如下图所示，RNAscope ISH 对应的红色信号点为 CXCL10 的 mRNA 信号。在这里，由于趋化因子本身为分泌型蛋白，免疫组化的方法很难进行组织学定位，而 RNAscope 方法可以很好地解决这个问题^[6]。

目前，针对新型冠状病毒 SARS-CoV-2 设计的 RNAscope manual 试剂盒配套探针如下：

与传统的 RNA 原位杂交相比，RNAscope 技术属于新一代 RNA 原位杂交技术，其特异性的双 Z 探针设计避免了传统长链 RNA 探针的弊端，配以自身级联放大检测原理，可以高效敏感地检测到目标 RNA。

在实际应用过程中，这项技术有许多诸多优点。

✦ 应用广泛：使用 RNAscope 技术，靶点 RNA 为大于等于 300 个碱基的特异序列，即可进行探针设计。因而 RNAscope 技术可以应用于几乎所有物种，所有组织以及所有基因的检测。

✦ 特异性强：RNAscope 独特的双 Z（ZZ）探针设计有效的防止了探针的非特异性结合，同时降低了背景干扰。由于结合在非特异性位点的单个的 Z 探针不会产生完整的信号放大分子结合位点，并会在杂交过程中被洗脱掉，从而防止非特异性信号的放大，使得探针的信号具有高度特异性。探针设计合成需要 2～4 周时间即可完成。

✦ 灵敏度高：RNAscope 方法检测每个 RNA 分子时，只需三对双 Z（ZZ）探针即可完成杂交和信号的可视化。

✦ 单分子可视化和单细胞定量：使用 RNAscope 技术杂交上三对及以上双 Z 探针即可在标准的显微镜下呈现可观察到的点状信号。ACD 公司提供的分析软件更可以定量每一个单细胞内 RNA 的表达水平。

✦ 兼容降解的 RNA：由于 RNAscope 三对双 Z 探针即可检测到目标 RNA，而通常针对靶点 RNA 设计的探针为 20 对双 Z 探针，因而即使目标 RNA 发生部分降解，仍可以稳定有效地检测到靶点 RNA。

✦ 检测结果稳定一致性：RNAscope 技术用到的探针以及所有检测试剂全部由工业化合成，且该技术针对不同样本类型（冰冻切片，石蜡切片，悬浮细胞，贴壁细胞等）已经有成熟的实验操作流程，故使得 RNAscope 技术检测结果具有稳定性和一致性。除了可以在实验室进行手工操作外，该产品也可以在 Leica 以及罗氏 Ventana 自动平台上运行，为结果的一致性和稳定性提供了可靠的依据。

✦ 多通道多靶点同时检测：由于 RNAscope 技术可以同时进行多通道探针杂交以及信号放大，故在可见光检测中可以在同一张切片上同时检测两个靶点；而在荧光检测过程中，可以在同一张切片上检测三个或三个以上靶点 RNA。

以上 RNAscope 这些优势，相信在 SARS-CoV-2 的原位研究中能够帮到大家，在相关病毒实验中的使用，小伙伴们也可以查阅下面的参考文献。

文章来源：Bio-Techne

图片来源：Bio-Techne