责编 | 酶美
泛素-蛋白酶体系统中，决定底物特异性的是E3泛素连接酶。其中最大类的E3是CRL泛素连接酶（CullinRING E3 Ligases）, 占哺乳动物体内所有E3的近50%。CRL由一个Cullin骨架蛋白（共七种:Cul1-3，Cul4A-B, Cul5和Cul7）、一个和E2结合的RING结构域蛋白（Rbx1或Rbx2）、一个接头蛋白（adaptor）以及约两百个底物识别亚基（substrate receptor）组成【1】。CRL介导了总蛋白泛素化的 20%，其家族成员在多种癌症中高表达或活性上调，参与了细胞周期、生长、代谢、存活、自噬、迁移和免疫逃逸等过程相关蛋白的异常降解，是潜在的肿瘤治疗重要靶点【2】。此外，CRL 还是最近兴起的蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC,Proteolysis Targeting Chimera）小分子药物所倚仗的泛素连接酶（特别推荐 | PROTAC技术的机遇及挑战 ）。
为防止底物的组成性降解，E3泛素连接酶的活性通常需要被紧密调控。CRL泛素连接酶受拟素化修饰（Neddylation，一种基于类泛素分子Nedd8的共价修饰【3】）动态调控。拟素化E1酶的抑制剂MLN4924是治疗癌症的三期临床药物。COP9 Signalosome（CSN）特异催化CRL的去拟素化（deneddylation）。CSN与CRL紧密互作，在抑制CRL拟素化及酶活的同时也保护了CRL不被自泛素化降解【4】。因此，CRL何时被何种信号激活或抑制——即CRL的活化-灭活循环——是由CRL-CSN复合物的组装和解离动态调控的。近期CRL-CSN复合物的冷冻电镜结构开始被报道【5】，但CRL-CSN复合物的组装和解离机制还不是很清楚。
2020年2月11日，南方科技大学生物系饶枫课题组和汪涛课题组（现深圳湾实验室）合作在美国科学院院刊PNAS在线发表题为“Basis formetabolite-dependent Cullin RING ligase deneddylation by the COP9 Signalosome”的研究论文【6】，通过综合性运用生物化学、结构生物学、化学生物学及遗传学等研究手段，揭示了代谢小分子六磷酸肌醇（IP6）作为分子“胶水”促进CRL-CSN复合物组装和Cullin去拟素化的功能、机制和进化保守性。
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IP6是源于GPCR信使IP3的一种高丰度多磷酸肌醇代谢物，功能广泛。为研究IP6如何调控CRL泛素连接酶，研究人员首先使用多种生化手段证明IP6主要通过与CSN亚基2（CSN2）结合，并作为CSN的催化辅因子（catalytic cofactor）直接参与招募Cul4/Rbx1并加速Cullin去拟素化，是泛素连接酶CRL和去拟素酶CSN之间的分子“胶水”。
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为进一步理解IP6的作用机制，研究团队成功解析了IP6-CSN2复合物的高分辨率（2.5Å）晶体结构，在CSN2蛋白里清晰的看到IP6小分子的电子云和结合模式，突变关键的结合位点如K70，可在体外或细胞内完全打破两者之间的相互作用，同时增强拟素化的稳定性。为解析IP6如何同时招募Cul4/Rbx1, 研究团队利用所解析的高分辨率晶体结构对CRL4-CSN复合物的冷冻电镜(Cryo-EM)结构进行装配，意外的发现了和IP6完美匹配的电子云，并鉴定出Rbx1上的K25/26残基和IP6直接互作。鉴于IP6的结合口袋由CSN2和Rbx1组成，Cul4不直接参与，研究团队提出IP6是光谱的CRL-CSN分子间胶水的假设，并进行了体内和体外试验验证。这些结果阐明了IP6调控CRL-CSN复合体组装的机理，暗示IP6小分子的代谢是复合物解离的调控路径。
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IP6的结合口袋在进化上从酵母到植物到人都高度保守，说明非常重要。的确，研究团队把CSN2-K70E突变敲入小鼠，发现会导致胚胎死亡。而在酵母里，CSN2-K70E突变体也无法回补Csn2敲除后酵母对紫外辐射不耐受的表型。这些结果说明IP6对CRL-CSN的调控进化上保守，功能上重要。
最后，研究团队还证明IP6辅助CSN把CRL从E2泛素结合酶CDC34上竞争下来，从而保护当底物被降解后，CRL不被自泛素化降解，阐明了CRL泛素连接酶活性循环的最后一步的发生机理。
这是饶枫团队继2014年在PNAS杂志发文报道IP6激酶IP6K1是介导紫外光激活CRL4泛素连接酶从而启动核苷酸切除修复的开关【7】,2016年在PNAS杂志发文报道IP6及其合成酶IP5K参与CRL-CSN互作【8】之后，围绕CRL-CSN复合物动态组装的CRL活性调控系列研究成果，为靶向CRL泛素连接酶明确了新靶点。
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这项工作由饶枫和汪涛实验室合作完成，得到了霍华德休斯研究所郑宁教授，北京生命科学研究所黄牛和杜立林研究员，以及南开大学周传政教授等的大力帮助。饶枫课题组的蔺红，张晓哲与汪涛课题组的刘丽是论文的共同第一作者。饶枫与汪涛是论文的共同通讯作者。
因课题需求，饶枫副教授实验室现招聘多名细胞、生化、或生理/神经方向博士后及研究助理，博士后待遇按深圳市标准执行。有意者请将简历发至 raof@sustech.edu.cn。课题组主页：http://faculty.sustech.edu.cn/raof/
原文链接：
https://www.pnas.org/content/early/2020/02/10/1911998117
制版人：小娴子
1. Rusnac, D. V., and Zheng, N. (2020)Structural Biology of CRL Ubiquitin Ligases. Adv Exp Med Biol 1217,9-312. Liu, J., Peng, Y.,Zhang, J., Long, J., Liu, J., and Wei, W. (2020) Targeting SCF E3 Ligases forCancer Therapies. Adv Exp Med Biol 1217, 123-1463. Wei, W., Sun, Y.,Cao, C., Chang, Z., Chen, C., Chen, Q., Cheng, J., Feng, R., Gao, D., HU, R.,Jia, L., Jiang, T., Jin, J., Li, H.-h., Li, W., Liu, C., Liu, X., Ma, L., Miao,S., Rao, F., Shang, Y., Song, Z., Wan, Y., Wang, H., Wang, P., Wang, Z., Wu,M., Wu, Q., Xie, Q., Xie, S., Xie, Z., Xu, P., Xu, Z.-H., Yang, B., Yang, C., Ying,M., Zhang, H., Zhang, L., Zhao, Y., Zhou, J., Zhu, J., Wang, L., Zhang, H.,Wang, C., and Qiu, X.-B. (2018) Ubiquitin-like proteins and their Chinesenomenclatures; 类泛素蛋白及其中文命名;. Science Bulletin 63, 2564-25694. Rao, F., Lin, H.,and Su, Y. (2020) Cullin-RING Ligase Regulation by the COP9 Signalosome:Structural Mechanisms and New Physiologic Players. Adv Exp Med Biol 1217,47-605. Cavadini, S.,Fischer, E. S., Bunker, R. D., Potenza, A., Lingaraju, G. M., Goldie, K. N.,Mohamed, W. I., Faty, M., Petzold, G., Beckwith, R. E., Tichkule, R. B.,Hassiepen, U., Abdulrahman, W., Pantelic, R. S., Matsumoto, S., Sugasawa, K.,Stahlberg, H., and Thoma, N. H. (2016) Cullin-RING ubiquitin E3 ligaseregulation by the COP9 signalosome. Nature531, 598-6036. Lin, H., Zhang,X., Liu, L., Fu, Q., Zang, C., Ding, Y., Su, Y., Xu, Z., He, S., Yang, X., Wei,X., Mao, H., Cui, Y., Wei, Y., Zhou, C., Du, L., Huang, N., Zheng, N., Wang,T., and Rao, F. (2020) Basis for metabolite-dependent Cullin-RING ligasedeneddylation by the COP9 Signalosome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 10.1073/pnas.19119981177. Rao, F., Xu, J.,Khan, A. B., Gadalla, M. M., Cha, J. Y., Xu, R., Tyagi, R., Dang, Y.,Chakraborty, A., and Snyder, S. H. (2014) Inositol hexakisphosphate kinase-1mediates assembly/disassembly of the CRL4-signalosome complex to regulate DNArepair and cell death. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 111, 16005-160108. Scherer, P. C.,Ding, Y., Liu, Z., Xu, J., Mao, H., Barrow, J. C., Wei, N., Zheng, N., Snyder,S. H., and Rao, F. (2016) Inositol hexakisphosphate (IP6) generated by IP5Kmediates cullin-COP9 signalosome interactions and CRL function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 113, 3503-3508