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光动力学疗法（PDT）是光敏剂（PS）与相应波长的光作用发生光动力反应，产生活性氧（ROS），从而杀死肿瘤细胞的治疗方法。其具有创伤小、毒副作用小、选择性好、可重复性好等优点。然而，由于传统PS固有的聚集猝灭效应（ACQ）、体内肿瘤缺氧微环境和内在的抗氧化性等因素的影响，导致目前的临床PDT实际效率比较低下。目前，大多数广泛使用的PSs（如卟啉衍生物）都会在水中发生聚集，出现荧光猝灭和减少生成ROS现象都会对降低PDT的实际疗效。因此，非常有必要开发出具有聚集态的高荧光和高光毒性的新型PSs。此外，肿瘤微环境（TME）中缺氧不利于ROS的生成，也会降低PDT效率。虽然通过MnO2、纳米级金属有机骨架（MOFs）等可以提高O2浓度，以增强PDT的作用，但是仅增加O2浓度还不够，因为被激活的癌细胞内存在的抗氧化物质（如GSH）会消耗掉氧气。在PDT治疗后，癌细胞过表达B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）来响应PDT，Bcl-2产生更高的GSH细胞浓度，从而将细胞内的氧化还原电位变为更弱的状态。当GSH与ROS反应时，就会产生PDT抗性。因此，使用Bcl-2抑制剂会消耗癌细胞内GSH，以促进癌细胞的凋亡。基于此，新加坡国立大学的刘斌教授（通讯作者）团队报道了一种含有AIE PSs的无载体杂化纳米球，以同时解决ACQ、TME缺氧和内在抗氧化性的问题。通过铁离子（Fe3+）、TPEDCC（具有对称二羧酸基团的AIE PSs）和Sabutoclax（具有对称多酚基团的Bcl-2抑制剂）的自组装即可制备该杂化纳米球（图1）。其中，加入的Fe3+离子通过类芬顿（Fenton-like）反应产生单线态氧（1O2）和O2以克服肿瘤微环境的缺氧现象。同时，引入了Sabutoclax，以抑制Bcl-2活性，进而降低肿瘤的内在抗氧化性。通过降低GSH含量，触发细胞色素-c的释放和“铁死亡”（ferroptosis），最终提高PDT的效率。图1、TPEDCC、Sabutoclax的化学结构以及杂化纳米球合成和作用示意图解析：如图2所示，作者以2-((4'-(2,2-双(4-甲氧基苯基)-1-苯基乙烯基)-[1,1'-联苯]-4-基](苯基)亚甲基)丙二腈（TPEDC）为原料，快速的合成了具有对称双羧基的TPEDCC。接着，将TPEDCC（DMSO中为5mg mL-1）和Sabutoclax（DMSO中为5mg mL-1）分别加入到Fe3+离子水溶液中，在85℃下搅拌过夜制备该杂化纳米球。然后，作者对该纳米球进行了理化表征，其结果如图3所示。在超滤后，通过动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）证明该杂化纳米球的粒径为50±2.6 nm（图3A）。通过DLS在不同时间点的水溶液中研究了杂化纳米球的稳定性，发现该杂化纳米球在水溶液中可以稳定存着。利用荧光光谱发现，TPEDCC和杂化纳米球的吸收波长都在660 nm左右，未发生明显变化（图3B）。利用X射线光电子能谱（XPS）测量，发现纳米球中铁离子在711.0 eV处出现特征吸收峰，其是Fe3+（2p3/2，图3C）。此外，高角度环形暗场扫描TEM-能量色散X射线光谱（HAADF-STEM-EDS）元素图谱确认了纳米球中C、N、O和Fe的均匀分布（图3D）。解析：如图4A所示，纳米球分解ABDA信号的效率与自由TPEDCC相当。作者在不同pH的缓冲液中研究了杂化纳米球的体外药物释放行为，以模拟不同的细胞内环境。在中性环境中，药物释放的时间最长，而酸性条件下，超过48％的药物在48 h内即被释放出来（图4B）。因此，在酸性肿瘤微环境有利于裂解弱的超分子相互作用和配位键，可以加速药物的释放。作者以MDA-MB-231乳腺癌细胞为模型，研究了其细胞摄取和体外PDT性能。如图4C所示，将MDA-MB-231细胞与纳米球（10 μM）孵育后，红色荧光随时间增加，表明纳米球可被细胞内吞。在不同制剂处理后，测试了MDA-MB-231和3T3细胞的体外细胞毒性实验。在黑暗中孵育48 h后，纳米球和TPEDCC对两种细胞系的毒性均可以忽略不计，具有良好的生物相容性（图4D）。当用410 nm激光照射细胞时，杂化纳米球对MDA-MB-231细胞的细胞毒性最强，IC50值为4.67±0.02 μM（图4D），但是对正常3T3细胞系基本没有毒性。此外，细胞凋亡试验表明，纳米球在MDA-MB-231细胞中引起最高的凋亡率（61.6％）。通过共聚焦图像显示在激光照射下，纳米球和TPEDCC处理的MDA-MB-231细胞组检测到亮绿色荧光（图4E）。流式细胞仪定量分析表明，杂化纳米球处理的细胞发出最强的绿色荧光，而无激光照射的组仅观察到了非常弱的绿色荧光（图4E）。因此，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2可以降低细胞内PDT抵抗力以提高PDT效率。解析：作者进一步对带有MDA-MB-231肿瘤细胞的裸鼠进行体内研究，以评估图像引导的PDT疗效。众所周知，适当尺寸的纳米粒子通常具有被动靶向能力和更长的循环时间。在将纳米球（10 mg kg-1，200 μL）静脉注射到荷瘤小鼠中后（图6A），体内成像显示在肿瘤部位积聚的纳米球信号在4 h达到最大，并保留了该信号长达6 h。通过组织切片分析，发现该纳米球主要作用于肝脏，组织分布图与体内成像结果是一致（图5B）。体内成像结果表明，该杂化纳米球具有良好的肿瘤被动靶向能力，并具有图像引导PDT的巨大潜力。【小结】
综上所述，作者通过协调驱动自组装，将Fe3+、AIE PSs（TPEDCC）和Bcl-2抑制剂（Sabutoclax）整合到单个纳米球体中，制备了无载体的杂化纳米球。在激光照射下，该纳米球表现出高ROS效率的明亮荧光，使其成为图像引导PDT的理想候选物。当肿瘤细胞内吞纳米球后，通过Fe3+的类芬顿反应增加了胞内的O2浓度。此外，沙丁酸杆菌和“铁死亡”信号通路可以减轻TPEDCC的细胞内PDT抗性。体外和体内实验结果表明，多功能杂化纳米球是一种用于图像引导的增强PDT的有前景纳米平台。Hybrid Nanospheres to Overcome Hypoxia and Intrinsic Oxidative Resistance for Enhanced Photodynamic Therapy . ACS Nano, 2020, DOI: 10.1021/acsnano.9b09032.来源：高分子科学前沿
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