Nature | 蛋白酶体在应激条件下可发生依赖于泛素化修饰的相分离

撰文 | YQ

责编 | 兮

泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system, UPS）是细胞内蛋白质降解的主要途径，参与细胞内大多数蛋白质的降解，对目的蛋白具有高度的特异性和选择性。该降解途径在细胞内蛋白质量控制、细胞周期调控、信号转导、抗原呈递等生物学过程中发挥着重要作用【1】。泛素-蛋白酶体系统的失调与一些神经退行疾病、癌症等疾病的发生发展密切相关。

来自日本Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science， Laboratory of ProteinMetabolism的Yasushi Saeki课题组，长期致力于泛素-蛋白酶体途径的研究，在蛋白酶体结构解析，以及相关的方法学开发方面发表了一系列高水平文章。

近日，该课题组在Nature杂志发表了题为Stress- and ubiquitylation-dependent phase separation of the proteasome 的文章，报道了蛋白酶体在细胞处于应激压力下依赖于泛素化修饰的相分离现象，这种相分离可以促进目的蛋白的降解过程，这一过程可能对于细胞内的蛋白质量控制等方面起着重要的作用。

作者首先使用了一系列的刺激条件处理带有PSMB2-eGFP或者PSMD6-FusionRed标记的细胞，发现在高渗（如：0.2M sucrose等）处理细胞的时候，细胞核内的蛋白酶体会聚集，形成明亮的“Foci”状结构，这种结构并不与细胞核内的已知的“Foci”状结构，如：PML nuclear bodies 和 Cajal bodies共定位，提示了这种“Foci”的结构可能是一种新的细胞核内结构。另外，这种“Foci”状结构与K48Ub具有明显的共定位，与K63Ub无明显的共定位，提示了该“Foci”结构是降解泛素化修饰蛋白的场所。并且作者使用Proteasome probe检测发现，这种结构中的蛋白酶体具有较强的活性。进一步的研究发现，这种高渗刺激形成的“Foci”会随着时间的延长而逐渐消失，当用MG132等抑制蛋白酶体活性后，这种“Foci”状结构会变大，荧光变强，并且几乎不会随着高渗处理时间的延长而消失。有趣的是，当加入泛素修饰途径的E1酶的抑制剂后，高渗的处理并不会诱导这种结构的产生，也就是说，这种“Foci”结构的形成，依赖于蛋白的泛素化修饰。这些实验结果，提示了细胞内的蛋白酶体在高渗压力的处理下，会发生明显地聚集，这种聚集的蛋白酶体具有较强的蛋白降解活性，并且这种聚集是依赖于一些蛋白发生泛素化修饰的。

作者通过定量蛋白质组学发现，细胞处于高渗压力下时，细胞内蛋白的泛素化修饰会升高，分析发现, Linker Histone，HSP90，以及一些核糖体组分蛋白的泛素化修饰水平明显上升。作者进一步的研究发现，在高渗的压力下会形成核仁压力，产生大量未被正确折叠进核糖体的游离的核糖体蛋白，这些蛋白会被泛素化修饰，并且进入前面发现的蛋白酶体形成的“Foci”状结构，从而被快速降解。

那么这种“Foci”状结构的物理化学本质到底是什么？作者在研究的过程中发现：这种“Foci”状结构能够两两相互融合成一个更大的“Foci”；这种“Foci”状结构呈圆形；当用1，6-己二醇处理后，这种“Foci”状结构会显著减少；另外，FRAP实验证实，这种结构与外界的物质处于高度动态交换中。这些结果表明，这种总Foci状结构是一种液滴状的结构，即这种Foci是通过液-液相分离形成。

进一步，作者试图寻找蛋白酶体发生相分离的调控机制，作者使用蛋白质组学的方式筛选与蛋白酶体具有相互作用的蛋白，并关注于ubiquitin-selectivechaperone p97, substrate-shuttling factor RAD23B 和ubiquitin ligase UBE3A几个在泛素蛋白酶体降解途径中发挥着重要作用的蛋白。作者通过使用抑制剂抑制或者基因敲除的方法检测这几个蛋白是否能够调控蛋白酶体在高渗压力下发生相分离的现象。作者发现，抑制p97后，Foci数量无明显变化，但是Foci的直径变大，敲除另外两个蛋白后，Foci数量减少，并且直径变小，其中敲除RAD23B最为明显。RAD23B蛋白同时具有泛素结合结构域以及结合蛋白酶体结构域，因此作者推测，RAD23B可能在蛋白酶体的相分离过程中总起着重要的作用。作者将纯化的RAD23B与K48Ub 泛素链在体外混合后，在有PEG存在的情况下，发生明显的相分离现象。当RAD23B的截断体并不能与K48Ub 泛素链在体外发生明显的相分离现象，与体内实验抑制，K63Ub泛素链与RAD23B形成相分离的能力明显减弱。

基于以上实验，作者提出了如下的模型：

当细胞处于高渗压力下时候，细胞内产生核仁压力、细胞体积缩小导致细胞内分子间拥挤度升高等原因导致一些不能被正确折叠的蛋白发生泛素化修饰，比如：核糖体蛋白等。这些大量的带上泛素化修饰的蛋白，与RAD23B蛋白结合，通过多价的相互作用驱动相分离的发生，在通过RAD23B的蛋白酶体结合结构域募集蛋白酶体，从而形成泛素化蛋白-RAD23B-蛋白酶体的相分离，促进泛素化蛋白的快速高效地被降解掉，当泛素修饰的蛋白被降解后，这种相分离由于没有泛素化修饰的蛋白，这中形成的Foci便消失。

是否这种泛素化修饰的蛋白与泛素结合蛋白发生相分离的机制在其他的蛋白上仍然可以发生？这种相分离可能的功能并不局限于调控该蛋白的降解，可能在多种重要的生物学过程中起着关键的作用。比如:要被自噬降解的蛋白上的标记的多泛素链与选择性自噬受体蛋白p62，通过液-液分离而被自噬体降解【2】。

另外，类泛素化修饰，比如：SUMO？UFM？等是否也存在同样的调控机制？另外一下类似泛素链的修饰，如PAR修饰是否也会有相应的机制形成相分离？已经有一些报道，比如PAR-chain能够促进相分离的发生，在DNA损伤修复过程中以及Stress granule形成中具有重要中作用【3,4】。最近，中科院生物物理所张宏组也在Protein & Cell 杂志报道了SUMO 修饰能够调控线虫SOP-2蛋白的相分离【5】。这些问题的进一步研究，将更好地阐明这些修饰的生理功能。

1. C. Pohl, I. Dikic, Cellular quality control by theubiquitin-proteasome system and autophagy. Science,(New York, N.Y.) 366, 818-822(2019).

2. D. Sun, R. Wu, J. Zheng, P. Li, L. Yu, Polyubiquitinchain-induced p62 phase separation drives autophagic cargo segregation. Cell Res, 28, 405-415 (2018).

3. Y. Duan et al.,PARylation regulates stress granule dynamics, phase separation, andneurotoxicity of disease-related RNA-binding proteins. Cell Res, 29, 233-247(2019).

4. M. Altmeyer et al.,Liquid demixing of intrinsically disordered proteins is seeded bypoly(ADP-ribose). Nature communications, 6, 8088-8088 (2015).

5. W. Qu, Z. Wang, H. Zhang, Phase separation of the C. elegans Polycomb protein SOP-2 is modulated by RNA and sumoylation.Protein Cell, 10.1007/s13238-13019-00680-y (2020).