Nature Methods | 类器官内单细胞信号网络分析

撰文 | 秦箫

责编 | 兮

肿瘤是一个高度异质化的细胞群体，拥有极其复杂细胞构成及其相互之间的信号传导通路【1】。近年来的癌症研究进展表明，为了进一步深化我们对肿瘤发生及发展机制的认识， 优化乃至革新当前的癌症治疗策略，细胞生物学家应逐步拓宽将不同种类的细胞孤立起来分别研究的传统思路，尝试建立合理的体外模型，重现体内组织的复杂性，研究不同细胞之间如何相互作用。

应对这一需求，类器官（Organoid）作为一种在体外培育而成的、具备其来源器官生理及病理学特征的多细胞三维结构，在过去的十年间取得了长足的发展。类器官的主要特征包括基于组织特异性干细胞功能的自主生长与定向分化，以及类同于其来源器官的自发性空间结构组织【2】。迄今为止，已有数十种不同组织、疾病模型及模拟发育的类器官问世，成为生物学家广泛使用的研究工具。然而，类器官有别于传统细胞系的培养方法与生长模式也为其数据获取与分析处理带来新的挑战。

首先，类器官的三维属性使得传统的显微成像技术受限于景深与分辨率，不再能够呈现完整深入的图景。其次，由于类器官需要借助于细胞外基质的支持而生长，而目前通用的细胞外基质Matrigel是一种动物来源的富蛋白组分，这很有可能成为下游数据分析处理的潜在干扰因素。最后，类器官保留了其组织来源的异质性与复杂性，这是它们作为体外模型的优势，却也不可避免地降低了整个系统的信噪比。因此，类器官研究领域在数据获取与分析处理方面亟待创新。

2020年2月17日，来自伦敦大学学院癌症研究所的Chris Tape实验室（第一作者为秦箫博士）在Nature Methods杂志发表文章Cell-type-specific signaling networks in heterocellular organoids，报道了基于质谱流式细胞分析技术开发出的类器官内单细胞信号网络分析的新方法。

作者首先描述了如何将现有的单细胞质谱流式分析方法应用于类器官培养系统。为了确保类器官的细胞表型不为下游实验操作所破坏或影响，所有细胞将由多聚甲醛（PFA）原位固定，继而被分解为单细胞悬液，用于单细胞质谱流式实验。作者在实验流程中进一步加入了细胞周期的标记物，并将细胞类别及蛋白翻译后修饰（post-translational modification, PTM）作为研究的重点。这一方法首次实现了类器官内细胞种类、细胞周期状态及蛋白翻译后修饰在单细胞水平的综合分析。

作者将这一方法应用于野生型小鼠小肠上皮类器官体，并以earth mover’s distance (EMD) 【3,4】和density resampled estimation of mutual information (DREMI) 【5】为量化标准，揭示了小鼠小肠类器官体内六种主要细胞类型的蛋白翻译后修饰信号通路网络。作者对实验数据进行主成分分析（principal component analysis, PCA），结果表明细胞周期状态是细胞内蛋白翻译后修饰信号网络调控的决定性因素，甚至比细胞类型发挥着更为重要的作用。

进一步地，为了将这一方法推广至涉及更多实验条件也因而更为复杂的类器官实验系统，作者开发了依托于硫醇基化学反应的、适用于现有质谱流式分析方法的类器官标记系统（Thiol Organoid Barcoding in situ, TOBis）。作者首先验证了TOBis可以有效标记类器官细胞，进而证明了TOBis可以越过细胞外基质Matrigel的屏障（不同于现有的基于氨基反应的细胞标记方法），实现类器官细胞的原位标记。这使得高通量类器官单细胞质谱流式分析成为可能。

最后，作者将整合了TOBis的类器官质谱流式分析方法应用于以小鼠大肠上皮类器官为核心的结肠癌肿瘤微环境模型，首次在单细胞水平揭示了不同致癌基因突变与细胞外微环境中纤维细胞、巨噬细胞对类器官蛋白翻译后修饰信号网络的调影响。实验结果表明，积累了致癌基因突变的类器官细胞能够脱离对纤维细胞的依赖，自发性地驱动自身生长。微环境、间质成分和免疫细胞可以有效上调或下调细胞内蛋白翻译后修饰的激活水平，而基因突变则可能更为根本地重构了细胞内蛋白翻译后修饰的信号网络。

综上，本文描述的方法实现了类器官内单细胞水平的信号网络分析，为更为深刻理解和全面利用作为体外生物模型的类器官提供了新的选择。

1. Hanahan, D. & Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell 144, 646–674 (2011).

2. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell 165, 1586–1597 (2016).

3. Levine, J. H. et al. Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis. Cell 162, 184–197 (2015).

4. Orlova, D. Y. et al. Earth Mover’s Distance (EMD): A True Metric for Comparing Biomarker Expression Levels in Cell Populations. PLOS ONE 11, e0151859 (2016).

5. Krishnaswamy, S. et al. Conditional density-based analysis of T cell signaling in single-cell data. Science 346, 1250689–1250689 (2014).