华南师范大学生命科学学院范瑞芳教授团队通过小鼠试验发现,孕期和哺乳期暴露于环境剂量的双酚 A 可能对子代神经系统发育产生持续的副作用。具体而言,孕期个体可能通过羊水、胎盘、卵泡液、乳汁等途径,让子一代个体间接暴露于双酚 A 中,影响其神经发育,进而使学习记忆行为退化,这一遗传毒性对子代雄鼠更为明显。基于小鼠实验结论,研究团队建议孕期妇女减少使用含 BPA 的塑料制品、接触热敏纸张和食用罐头食品,以降低 BPA 暴露风险。
图片来源:Pixabay
撰文 雒亦凡 / 张海彬 / 范瑞芳
编辑 戚译引
双酚 A(bisphenol A,简写为BPA)是环境雌激素的一种,又名2,2-二(4-羟基苯基)丙烷、二酚基丙烷、2, 2-双对酚丙烷,是工业聚碳酸脂、环氧树脂、聚树脂、聚酚氧树脂类塑料的前体,广泛应用于食品包装材料与饮料容器、罐头内包装、婴儿用品、杀真菌剂、及医疗器械、电讯器材的生产中,也是牙齿密封剂、牙科填充剂的原料(Geens et al., 2012)。此外双酚A可以作为显色剂用于无碳复写纸和热敏纸表面,以实现复写或对热源产生反应而显色(Geens et al., 2012; Lu et al., 2013)。
图 1. 双酚 A 用途
BPA 是一个公认的荷尔蒙干扰剂,进入机体后与细胞内的雌激素受体结合,通过多种机制产生拟雌激素或抗雄激素作用,从而干扰内分泌系统的正常功能。而内源性激素在塑造大脑发育过程中形成行为模式的网络中起着关键作用(Bonthuis et al., 2010)。BPA 通过与受体的竞争性结合,放大或干扰雌激素对脑发育的调节作用,特别是处于性别及生理发育敏感阶段的胎儿以及婴幼儿,酶的代谢与补偿机制不完善,是 BPA 的易感人群。流行病和动物学实验显示 BPA 可以穿过血脑屏障,与雌激素受体结合而导致一系列的生理反应,进而损伤神经系统和行为能力。因此,许多国家已经采取措施禁止或限制BPA在婴幼儿产品中的销售。BPA 被认为是低毒性,从毒理学的剂量-效应关系上来看,低剂量意味着较弱的生理效应,因此很多研究认为摄入安全剂量下的 BPA 对成人影响不大,而忽视了母亲暴露于 BPA 是否对后代产生负面健康影响。
母亲暴露于 BPA 后,是否具有遗传毒性目前看有争议。Bernal和 Jirtle 认为孕期 BPA 暴露可能存在可遗传的生殖毒性,导致子代雄性个体精子数量和活性降低(Bernal and Jirtle, 2010),且这种性状会传递到第三代,但 Audebert 的研究则显示 BPA 对人的肾、肠、肝细胞是没有遗传毒性的(Audebert et al., 2011)。考虑到 BPA 可通过羊水、胎盘、卵泡液和乳汁等被胎儿摄入,因此很有必要研究孕期和哺乳期母体摄入 BPA 后是否对后代的神经发育具有影响,这种影响是否具有传代效应。
华南师范大学生命科学学院的范瑞芳教授团队就这一问题进行了长达 4 年的研究,近期,其成果发表在了国际知名毒理学期刊 Toxicology 上。
实验以小鼠为模型,通过模拟人类日常不同情况下的 BPA 暴露,分别设置对照组孕鼠(不暴露于 BPA)、低浓度组暴露孕鼠(其暴露浓度参考普通人群日暴露均值,远低于 2012 年美国环境保护署给出的参考剂量(50 国环境保护署给出)或 2015 年欧洲食品安全局设定的可接受的估计每日摄入量(4 欧洲食品安全局设)、中浓度组孕鼠(其暴露浓度为美国环保署制定的 BPA 日摄入安全剂量)及高浓组暴露孕鼠(100 倍的 BPA 日摄入安全剂量)。
从怀孕第 1 天起直至子一代鼠(F1)出生后 21 天断奶,给母鼠(F0)每日连续进行 BPA 的灌胃染毒。随后将 F1 代小鼠分成 2 批,一批从 28 天起进行 Y 迷宫训练检测其空间学习记忆能力、彗星电泳实验检测脑细胞 DNA 损伤程度、苏木精-伊红染色(HE)法和高尔基染色法分析大脑海马区神经元数目和形态变化、液相色谱串联质谱法检测神经递质含量;另一批 F1 代小鼠在出生后 42 天、性成熟时进行交配产生子二代小鼠(F2)并重复 F1 代动物的行为和细胞实验,在此期间不再进行 BPA 的染毒暴露。最后通过从综合形态学、分子生物学和动物行为学的各项实验数据分析孕期和哺乳期小鼠暴露于不同浓度 BPA 对 F1 和 F2 代小鼠的神经毒性效应。
图 2. 实验思路
DNA 是遗传物质的载体,DNA 的改变可能会带来性状的变异。为了验证孕期和哺乳期 BPA 暴露是否改变小鼠后代的 DNA,产生可遗传的神经毒性?我们采用彗星电泳实验检测了 F1 和 F2 代小鼠脑部细胞的 DNA 损伤程度。结果显示在低浓度和中浓度 BPA 孕期和哺乳期暴露下,F1 代雌鼠和雄鼠的脑细胞 DNA 损伤与对照组相比存在显著性差异,然而在F2代中却没有发现明显的 DNA 损伤。Gensan 和 Keating 的体外细胞实验结果揭示 BPA 暴露可以增强 DNA 修复基因的表达(Gensan and Keating 2016),因此我们推测 F2 代小鼠脑细胞的基因损伤可能通过表观遗传机制得到一定修复。
图 3. 母体 BPA 暴露对后代脑细胞 DNA 损伤的影响。(A) F1代小鼠脑细胞典型彗星实验图片 ;(B)不同 BPA 处理后 F1 小鼠的脑细胞的尾部 DNA %、尾长和尾矩。
为了进一步验证母体孕期和哺乳期 BPA 暴露是否出现传代神经毒性效应,我们着重研究了与神经系统发育和学习记忆能力密切相关的大脑海马体。海马体主要负责长时记忆的存储转换和定向等功能,由 CA1、CA2、CA3 以及海马体齿状回(DG)等区域组成,而神经元是构成各区神经功能的基本单元,神经元数目多少与其学习功能的强弱密切相关。HE 染色的结果显示母体孕期和哺乳期中浓度和高浓度的 BPA 暴露不但会导致 F1 代雌、雄鼠 DG 区、CA1 区神经元数目减少,也会导致 F2 代雌、雄鼠海马区神经元数目减少,说明孕期孕期和期 BPA 暴露对子代小鼠具有神经毒性的跨代遗传效应。有意思的是,我们发现即使是低浓度的 BPA 暴露也会减少 F2 代雄鼠 DG 区、CA1 区神经元数目,这再次印证了所谓的“神经元的安全剂量”可能并不安全。
图4. (A)F1 和 F2 代雄性小鼠海马区 CA1、CA3 和 DG 区域的典型图像;(B)F1 和 F2 代雌性小鼠海马区 CA1、CA3 和 DG 区域的典型图像;(C)F1 代小鼠海马区 CA1、CA3 和 DG 区神经元数量;(D)F2 代小鼠海马区 CA1、CA3 和 DG 区神经元数量(图像比例:100µm。与对照组小鼠比较,p<0.05,**p<0.01)。F1 代小鼠实验每组有雌雄鼠各 9 只,F2 代小鼠实验每组有雌雄鼠各 6 只。
树突和树突棘是海马区学习记忆信息储存的基础。树突是自神经元胞体伸出的较短而分支多的突起,树突接受来自其他神经元的冲动,因此它的分布范围可代表该神经元接受刺激的范围。树突的分支上有树突棘或叫树突小芽,与其他神经元末梢形成突触。一般来讲,树突分叉点越多、树突长度越长、树突棘密度越高表示其神经网络的复杂程度越高,学习记忆能力也越强。通过高尔基染色后对海马区神经树突的形态分析显示母体 BPA 暴露后,与对照组相比,F1 和 F2 代雄鼠海马体 CA1 区树突棘密度显著降低,F1 代雄鼠暴露组与对照组和同浓度雌鼠相比,树突分叉点和树突总长也显著降低,但这种现象在雌鼠中则观察不到(见图 5)。这说明孕期和哺乳期母体 BPA 暴露对子代的神经毒性不但具有传代效应,且存在性别差异性,且 BPA 母体暴露对子代雄鼠的神经元形态损伤显著高于雌鼠。
图 5. BPA 暴露对子代小鼠海马树突状结构发育的影响。
(A)F1 雄性小鼠 CA1 锥体神经元树突状结构的典型图像;
(B, C)暴露组 F1 代雄鼠 CA1 树突交点和树突总长明显减少;
(D,E)F1(D) 和 F2(E) 代小鼠 CA1 锥体神经元棘树突轴的典型图像;
(F)母体 BPA 暴露显著降低 F1 和 F2 代小鼠 CA1 区树突棘密度。每组实验雌雄性各 6 只。(与对照组比较,p<0.05,**p<0.01)
BPA 暴露也显著扰乱海马区与记忆相关的神经递质含量(包括谷氨酸:Glu、γ-氨基丁酸:GABA、乙酰胆碱:ACh 和 5-羟色胺:5-HT),其中谷氨酸是兴奋性神经递质,而 γ-氨基丁酸是抑制性神经递质,共同在脑区活动中起重要作用,它们的浓度失衡往往与一些精神疾病或神经疾病密切相关(Car and Wind, 1998)。实验结果显示,BPA 处理提高了 F1 代小鼠海马神经递质的浓度,降低了 Glu/GABA 比值。特别是中浓度和高浓度母体 BPA 暴露导致 F1 代雌、雄鼠海马区神经递质 Glu/GABA 比例显著下降,其趋势与海马 DG 区神经元数目的减少和海马 CA1 区树突棘密度的降低相吻合,说明 BPA 可能通过干扰海马体内 Glu/GABA 的比例平衡,间接破坏 DG 区、CA1 区的神经元形态,再进一步影响小鼠的学习记忆能力。
表 1:孕期 BPA 暴露后 F1 代海马神经递质浓度变化
(点击图片可放大查看)
* 或 **表示暴露组和对照组小鼠之间存在显著性差异(p< 0.05 or p< 0.01)。
分子生物学手段和神经元的形态分子只是从微观和局部来了解孕期和哺乳期母体 BPA 暴露对后代小鼠的神经毒性影响,仍需要整体的动物实验支撑。Y-迷宫是一种经典的用于研究啮齿类动物空间识别记忆能力的一种模型,能够有效地反映动物对新异环境的识别能力。本研究的 Y-迷宫实验结果显示,母体 BPA 暴露导致 F1 暴露雄性小鼠达标的试验次数和天数均显著增加。与对照组相比,BPA 暴露组的 F1 代雄鼠均要比对照组雄性小鼠晚 2-4 天达标。在 F2 代中,则没有观察这种现象。有趣的是,雌、雄鼠之间似乎天生在空间学习记忆方面存在差异,对照组中 F1 雌性小鼠需要进行更多的试验才能达到标准(p<0.05)(表2)。然而,经过不同的 BPA 处理,特别是低 BPA 和高 BPA 处理后,情况发生了逆转,即 F1 雄性小鼠比 F1 雌性小鼠需要更多的试验来达到学习标准(p<0.01)。以上结果说明,孕期和哺乳期母体 BPA 暴露确实会对后代的学习记忆行为产生影响,且对子代雄性的影响要大于雌性。但这种影响不具有跨代效应,仅限于子代。这种趋势和小鼠的脑部 DNA 损伤和神经元的形态学变化似乎不一致,但不矛盾,因为 Y 迷宫实验是一个完整的动物行为实验,小鼠的行为与神经系统的多步骤动力学过程有关,包括增殖、分化、迁移、轴突扩展、突触形成和程序性细胞死亡等(Rice and Barone Jr, 2000)。虽然其中部分功能受损,但可能通过其他通路进行了修复或补偿。
表 2. 孕期不同浓度 BPA 暴露对 F1、F2 代小鼠空间学习记忆能力影响的比较
(点击图片可放大查看)
F1 代每组实验含 12 只雌雄鼠;F2 代每组实验含 10 只雌雄鼠。
* 或** 表示暴露组和对照组小鼠之间存在显著性差异(p< 0.05 or p< 0.01). p1 是对同浓度组雌、雄鼠间比较。
综上所述,孕期和哺乳期母体 BPA 暴露会通过损伤脑部 DNA、减少神经元数量、降低神经元复杂程度和改变神经递质浓度来降低后代小鼠的空间学习记忆能力,对 F1 代雄鼠的影响更甚。孕期和哺乳期母体 BPA 暴露虽可显著降低孙代雄性小鼠的 CA1 区神经元密度,但只能说母体 BPA 暴露具有传代神经毒性,尚无法认定这种影响具有遗传毒性。鉴于孕期和哺乳期暴露于环境剂量的 BPA 会对后代神经系统发育产生持续的副作用,我们建议除了做好婴幼儿的 BPA 暴露保护外,孕期和哺乳期妇女也需要减少接触含 BPA 的塑料产品、食品,以免对后代的神经发育产生不良影响。
扩展阅读:
新闻稿参考文献
[1] Geens T, Aerts D, Berthot C, et al. Gene Expression Profiling Analysis of Bisphenol A-Induced Perturbation in Biological Processes in ER-Negative HEK293 Cells [J]. Food Chem Toxicol, 2012, 50: 3725-3740.
[2] Geens T, Goeyens L, Kannan K, et al. Levels of bisphenol-A in thermal paper receipts from Belgium and estimation of human exposure [J]. Sci Total Environ, 2012, 435-436:30-33.
[3] Lu S, Chang W, Sojinu SO, et al. Bisphenol A in supermarket receipts and its exposure to human in Shenzhen, China [J]. Chemosphere, 2013, 92:1190-1194.
[4] Boudalia S, Berges R, Chabanet C et al. A multi-generational study on low-dose BPA exposure in Wistar rats Effects on maternal behavior, flavor intake and development [J]. Neurotoxicol Teratol, 2014, 41:16-26.
[5] Bernal AJ, Jirtle RJ. Epigenomic disruption: the effects of early developmental exposures [J]. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol, 2010, 88(10):938-944.
[6] Audebert M, Dolo L, Perdu E, et al. Use of the γH2AX assay for assessing the genotoxicity of bispenol a and bisphenol F in human cell lines [J]. Arch Toxicol 85:1463–1473.
[7] Geens T, Goeyens L, Covaci A. Are potential sources for human exposure to bisphenol-A overlooked? [J]. Int J Hyg Environ Health, 2011, 214(5):339-347.
[8] Car H, Wiśniewski K. Similarities and interactions between GABAergic and glutaminergic systems [J]. Roczniki Akademii Medycznej w Bialymstoku, 1998, 43:5-26.
[9] Rice D, Barone Jr S. Critical period Bialymsts of vulnerability for the developing nervous system: evidence from humans and animal models [J]. Environ Health Persp, 2000, 108(suppl3):511-533.