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原儿茶酸(Protocatechuic acid，PCA)可作为许多聚合物和药物的前体物质。由于化学法提取PCA存在提取率低且污染环境的缺陷，使得PCA的生物转化成为研究的新方向。本研究成功构建了对羟基苯甲酸-3-羟化酶的高效表达菌株BL21(DE3)/pET21a(+)-ρ-HBA-3H，并运用该工程菌细胞首次实现了原儿茶酸的生物转化，实现了PCA的高效率、无污染的绿色生产，为PCA工业化生产提供理论研究基础。

【背景】 原儿茶酸(Protocatechuic acid，PCA)是一些植物的主要活性成分，可作为许多聚合物和药物的前体物质，目前PCA的主要来源是利用化学法从植物中提取，然而该法提取率低且对环境造成一定程度的破坏。

【目的】 克隆对羟基苯甲酸-3-羟化酶基因ρ-HBA-3H并进行异源表达，利用该酶催化实现原儿茶酸的生物转化。

【方法】 以红球菌R04基因组DNA为模板，PCR扩增得到对羟基苯甲酸-3-羟化酶基因ρ-HBA-3H，构建重组基因工程菌BL21(DE3)/pET21a(+)-ρ-HBA-3H，诱导表达对羟基苯甲酸-3-羟化酶，在底物对羟基苯甲酸(ρ-Hydroxybenzoic acid，ρ-HBA)存在下进行PCA的生物转化，并对生物转化的条件进行优化。

【结果】 对羟基苯甲酸-3-羟化酶基因在大肠杆菌中实现了高效表达。通过生物转化PCA产量可达1.156 g/L。优化实验表明Mg²⁺、Triton X-100对转化效率无影响，增加反应体系的溶氧量及添加适量的吐温-80能够促进转化反应的进行。细胞连续转化基础上适量补充葡萄糖可以有效增加工程菌的转化效率，减少PCA的消耗。

【结论】 通过生物酶催化法实现了PCA的高效率、绿色生产，为其他重要发酵产品的工业化生产提供理论研究基础。

图 1　原儿茶酸的生物转化途径

Figure 1　Biotransformation pathway of protocatechuic acid

图 2　对羟基苯甲酸-3-羟化酶基因的PCR扩增

Figure 2　PCR amplification of ρ-HBA-3H gene

图 3　重组质粒的菌落PCR扩增筛选

Figure 3　Colony PCR amplification identification of recombinant plasmid

图 4　ρ-HBA-3H蛋白的SDS-PAGE分析

Figure 4　SDS-PAGE analysis for the expression of ρ-HBA-3H protein

图 5　对羟基苯甲酸和原儿茶酸的紫外吸光光谱Figure 5　The UV absorbance spectrum of ρ-HBA and PCA

图 6　对羟基苯甲酸和原儿茶酸的高效液相色谱图Figure 6　HPLC chromatogram of ρ-HBA and PCA

图 7　产物原儿茶酸的检测

Figure 7　Detection of PCA

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