【生化】Angew：荧光探针用于可视化叶酸受体表达的肿瘤
叶酸（Folic acid，FR）是一碳代谢途径和核苷酸合成所必需的物质，早在90年代就已作为癌症组织成像的靶向配体。40%左右的癌症中α型叶酸受体（FR-α）过表达，特别是卵巢癌等恶性组织，而除肾脏以外的正常组织均不会积聚叶酸及其结合物。即使与成像剂结合后，叶酸仍以高亲和力与FR-α结合，并经受体介导的内吞过程进入细胞。另外，近红外（NIR）荧光染料由于较深的组织渗透和较低的自发荧光而广受关注。然而，目前存在的叶酸-NIR荧光剂表现出非特异性吸附，需要24小时的冲洗才能显示肿瘤区域（Scheme 1）。因此，开发一种NIR试剂用于检测体内FR高表达细胞显得尤为必要。
（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）
近日，日本东京大学的Yasuteru Urano教授课题组将含有羧基的硅基罗丹明通过带负电的三肽结构与叶酸配体相连接，设计合成了一种新型NIR荧光探针FolateSiR-1，其在30分钟内聚集在荷瘤小鼠的FR过表达区域且表现出高达83倍的肿瘤-背景比（TBR）。相关成果以“A Fluorescent Probe for Rapid,High-Contrast Visualization of Folate-Receptor-Expressing Tumors in Vivo”为题发表在Angew. Chem. Int. Ed.上（DOI: 10.1002/anie.201914826）。
作者首先进行化合物的合成，将叶酸谷氨酸部分与带负电的三肽Asp-Lys-Gly相连接，再将荧光团硅基罗丹明与Lys相连，获得化合物FolateSiR-1和FolateSiR-2（Figure 1a）。谷氨酸部分通过三肽链与染料连接，减少了化合物与FR-α的非特异性结合，带负电荷的三肽链降低了化合物的细胞膜通透性。光谱数据表明，FolateSiR-1和FolateSiR-2在NIR区表现出相似的吸收和发射光谱，量子产率分别为7.6%和5.1%（Figure 1）。
（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）
随后，作者将FolateSiR-1和FolateSiR-2应用于KB细胞和OVCAR-3细胞的成像中。在KB细胞组，经FolateSiR-1孵育细胞的细胞膜显示出明亮的荧光而细胞内无荧光点，且在1 mM叶酸竞争剂的存在下荧光消失；经FolateSiR-2孵育的细胞，在含有或不含有1 mM叶酸的情况下，细胞内均显示出荧光点（Figure 2a）。在OVCAR-3细胞组，经FolateSiR-1孵育细胞并没有显示出荧光，而经FolateSiR-2孵育的细胞则出现诸多荧光点（Figure 2b）。以上结果表明，FolateSiR-1几乎不存在非特异性吸附，在细胞成像中具有更优异的信噪比。
（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）
接下来，作者将FolateSiR-1和FolateSiR-2应用于离体小鼠胚胎的叶酸结合蛋白Folbp1（类似于人FR-α）的可视化。Folbp1的mRNA主要定位于发生融合的神经折叠的最背侧区域，随着神经折叠融合的进行，mRNA的表达延伸至相邻的未融合神经折叠区域（Figure 3a）。作者在37 ℃下用20 μM的FolateSiR-1或FolateSiR-2将胚胎染色30 min后进行荧光成像。用FolateSiR-1处理的胚胎在神经管闭合区域显示出强荧光，而在整个胚胎中显示出微弱的荧光（Figure 3b）；而用FolateSiR-2处理后的整个胚胎均表现出强荧光（Figure 3c）。胚胎的荧光成像结果进一步证明了FolateSiR-1具有特异性结合的特点。
（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）
为了进一步将FolateSiR-1和FolateSiR-2应用于荷瘤小鼠的肿瘤成像中，作者将FolateSiR-1或FolateSiR-2通过尾静脉注射至KB荷瘤小鼠中。30 min后，注射FolateSiR-1的小鼠在荧光成像中显示出明显的肿瘤部位，且具有极低的背景荧光，TBR高达83（Figure 4a，b）。同样的，解剖分离的肿瘤也显示出明亮的荧光。而同一时间注射FolateSiR-2的小鼠全身均显示出强荧光，即使在6 h后，TBR也仅为12（Figure 4c，d）。
（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）
最后，为了研究FolateSiR-1在术中肿瘤检测的潜在应用价值，作者选取卵巢癌肿瘤组织和临近肿瘤的正常组织进行成像实验。实验结果表明，FolateSiR-1成功地使卵巢癌肿瘤组织可视化，而正常组织几乎无荧光（Figure 5a），这与免疫荧光染色结果相一致（Figure 5b），证实了FolateSiR-1能够可视化离体肿瘤。
（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）
总而言之，作者设计并合成了一系列叶酸荧光染料偶联物，在进行细胞成像、胚胎成像以及肿瘤成像实验的比较后，发现FolateSiR-1具有高特异性和高信噪比，这为评估肿瘤组织内的药代动力学提供一定的价值。
●Chem. Sci.：基于空间弛豫增强探针在癌症中的NO光声成像效果
●JACS：基于机械酸的聚合物用于时间标记的机械变色现象
●Angew：基于化学反应的传感方法用于检测活细胞中的环氧合酶-2