治疗性疫苗临床试验研究学术资讯

来源：科学出版社

在多数持续性感染中，机体针对病原体的特异性细胞免疫应答在清除病原体中发挥主要作用。增强特异的细胞毒性T细胞（CTL）功能是治疗持续性感染的关键。因而在治疗过程中，从细胞免疫学角度，尤其是针对特异微生物抗原的CTL数量、功能及调控机制进行分析研究，更能真实预测和判定疗效。

01病毒特异性细胞毒性T细胞应答

特异性CTL应答的实验研究可主要集中在2个方面：特异性CTL数量检测和功能分析。经典的通过特异性肽段诱导CTL增殖的体外细胞培养方法仍然适用，在此基础上，近期出现了一些新的实验技术。
（1）MHC-肽四聚体（tetramer）、MHC-肽五聚体（pentamer）流式细胞技术测定病原特异性CTL数量：目前最常见的是采用HLA-A2分子与病原微生物肽段合成的MHC-肽四聚体检测受HLA-A2限制的针对肽段。我国乙肝患者中HLA-A2人群约占半数，因此该技术的应用具有重要的现实意义。
（2）对病毒特异性CTL功能分析技术：目前主要采用ELISPOT和流式细胞技术2种方法检测其分泌细胞因子功能。
（3）特异性CTL杀伤靶细胞能力测定技术：目前一般采用51Cr（Na51CrO4）标记的EBV转染的B细胞株作为靶细胞，按不同的效/靶（E/T）细胞比例与经病原微生物肽段（如core18～27 等）诱导培养的特异性CTL 共同孵育一定时间后，测定上清液中裂解靶细胞释放的51Cr水平，并根据对照孔结果计算百分裂解率。

（4）特异性CTL体外刺激培养技术：在免疫系统清除肝细胞内的HBV时，HBV抗原特异性CTL起着核心作用，其功能和数量直接影响着HBV病毒的清除和肝细胞的损伤。研究发现慢性乙肝患者刺激培养前新鲜PBMC 中HBV特异性CTL数均小于0.1%。目前已鉴定出多个受HLA-Ⅰ类分子限制的HBV不同抗原区段的CTL表位，如核心区（core18～27）、包膜区（envelope335～343）及聚合酶区（polymerase575～583）等表位。有研究证实在所有HBV特异性CTL中，HBV core18～27 特异的CTL相对其他HBV 抗原肽段的CTL较多，对病毒的清除更为重要。

02调节性T细胞的改变

调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）是近些年免疫学领域研究的热点，Treg作为独立的功能性T细胞亚群在防止自身反应性T细胞的活化及抑制其效应功能方面起着主导作用。
研究证实，在机体感染病原微生物时，体内的Treg数量增多并通过细胞接触的方式抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞的活化增殖、分泌细胞因子及杀伤靶细胞。Treg还可抑制NK细胞、B细胞及其他免疫细胞的功能。

Treg对效应T细胞的作用是抗原非特异性的，细胞因子机制和接触抑制同时发生作用，细胞因子机制中以IL-10、IL-35、TGF-β对效应T细胞的抑制作用占主导。其还可通过抑制抗原提呈细胞的功能，间接导致HBV特异性CTL功能下降。采用体内双光束扫描显微镜观察证实，在Treg缺失条件下，淋巴结内自身抗原特异性T细胞的活性也随之降低，T细胞与DC的接触时间更为持久。这说明Treg可以在DC活化未致敏T细胞时发挥其对两者稳定接触的削弱作用，从而对初期免疫反应产生影响。

研究发现在慢性乙肝患者外周血中Treg水平明显升高，Foxp3 mRNA水平明显高于健康人群。Treg可以通过抑制HBV特异性CTL的激活，一方面抑制过度免疫病理损伤，另一方面也可能导致病毒的持续性感染。

同样，在慢性重型肝炎的研究中也发现，Treg与疾病的发生、发展、转归及治疗疗效密切相关。如果能够抑制Treg的增殖和分化或阻断其调控途径，将为HBV慢性感染或肿瘤的免疫治疗提供新的手段。

03树突状细胞的免疫功能及测定

慢性感染主要是由于针对病原体的特异性细胞免疫功能低下，而具有抗原提呈作用的DC功能缺陷可能是导致细胞免疫低下的重要因素。
李兰娟等通过建立Treg、黏附细胞（AC）、HBV特异CTL相互作用的模型显示：慢性HBV感染者Treg可抑制CTL增殖，并且在无AC存在的情况下，Treg的抑制作用依然存在，同样不论Treg存在与否，AC也可抑制CTL增殖，而且在有黏附细胞、无Treg存在的条件下，CTL细胞增殖要比无AC、有Treg存在的条件下差。这对于进一步研究Treg、AC在CHB患者免疫发病机制中的作用，探讨将去除或干扰Treg、AC功能作为慢性乙肝免疫治疗策略提供了试验证据。这些结果将对其他持续性感染有借鉴作用。

随着免疫学研究发展，单细胞测序（single cell sequencing）技术正成为生命科学研究的焦点。此技术是在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组进行高通量测序分析的一项新技术。单细胞测序主要过程为先分离纯化单个细胞，并提取该细胞的DNA或RNA进行扩增后测序。它能够揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态，反映细胞间的异质性，单细胞转录组测序、基因组组装应用、人全基因组及全外显子测序，可在极短时间内同时获得数十万个单细胞转录组信息。相比于宏观组织样品的测序，单细胞测序对于细胞和组织的异质性具有更加明确的分辨。今后，可运用该技术监测免疫细胞进行抗病毒疗效观察及预测，从而实现临床-基础双向转化，促进治疗性疫苗的临床结合实验研究的实现。

来源：sciencepress-cspm 科学出版社

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