人参水溶性蛋白的分离纯化制备方法

• 摘要：

  本发明属于蛋白质分离纯化技术领域,具体涉及一种采用缓冲液抽提、硫酸铵沉淀和亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析分离纯化制备人参蛋白的方法.其是将人参匀浆液浸提后加入固体硫酸铵至80％饱和度,经Tris-HCl缓冲液平衡透析、高速离心后超滤、多种层析纯化后得到5种人参蛋白(Ginseng Protein)GP1-GP5,其中GP1为类RNA酶,GP3为壳多糖酶样蛋白,GP4为人参核糖核酸酶,GP2和GP5两种蛋白均为首次报道.本发明具有纯化效果好、上样量大、样品收率较高且可用于放大生产等特点.所得样品在SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳中除GP4以外均显示一条带,说明已达到电泳纯.

• 专利类型：

  发明专利

• 申请/专利号：

  CN200710055850.1

• 申请日期：

  2007.07.06

• 公开/公告号：

  CN101092448

• 公开/公告日：

  2007-12-26

• 发明人：

  赵雨 张巍 李红艳 惠歌 李银清 姜先刚 唐任能 幺宝金

• 申请人：

  长春中医药大学

• 主分类号：

  C07K1/36(2006.01)I,C,C07,C07K,C07K1

• 分类号：

  C07K1/36(2006.01)I,C07K4/10(2006.01)I,C07K14/415(2006.01)I,C07K1/34(2006.01)N,C07K1/30(2006.01)N,C,C07,C07K,C07K1,C07K4,C07K14,C07K1/36,C07K4/10,C07K14/415,C07K1/34,C07K1/30

• 主权项：

  1、人参水溶性蛋白的分离纯化制备方法,其包括如下步骤:(1).将鲜参切成小块,按1~3ml/g的比例加入含0.1~0.3mol/L NaCl、pH＝7~8的0.01~0.03mol/L Tris-HCl缓冲液匀浆,浸提后合并所得上清液,即为人参总蛋白粗提液;(2).向上述人参总蛋白粗提液中加入固体硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠或磷酸钠至70~90％饱和度,混匀后于1~10℃静置12~36小时,再于1~10℃、3000~10000r/min离心10~60min,取沉淀;然后按1~3ml/g的比例将沉淀溶于pH＝7~8、0.01~0.03mol/L Tris-HCl缓冲液后装入透析袋中,透析袋截留分子量为6000~8000Da,1~10℃透析12~36小时,透析保留液于1~10℃、3000~10000r/min离心10~60min,取上清液冷冻干燥后即为人参总蛋白样品;(3).将人参总蛋白样品上样于截流分子质量为10kDa的超滤仪进行超滤,分别收集大、小分子流出液,冷冻干燥后得到分子质量大于10kDa的大分子样品A1和分子质量小于10kDa的小分子样品A2;(4).将样品A1用pH＝7~8、0.01~0.03mol/L Tris-HCl缓冲液透析、透析保留液于1~10℃以10000~15000r/min离心5~15min、上清液经0.22~0.45μm滤膜过滤后上样于用此步骤缓冲液平衡好的Affi-gel(bluegel)亲和层析柱,洗柱直至样品的280nm处吸收峰回到基线,再用含1~2mol/L NaCl的此步骤缓冲液进行盐阶段洗脱,流速为0.1~3.0ml/min,分别收集得到未吸附样品A1B1和盐阶段洗脱样品A1B2;(5).将盐洗脱样品A1B2用pH＝4.0~6.0、0.01~0.03mol/L醋酸铵-醋酸缓冲液透析,透析保留液于1~10℃以10000~15000r/min离心5~15min、上清液经0.22~0.45μm滤膜过滤后上样于用此缓冲液平衡好的SP-Sepharose FF离子交换柱,洗柱直至样品的280nm处吸收峰回到基线,再用含0~1mol/L NaCl的此缓冲液进行盐梯度洗脱,流速为0.1~3.0ml/min,收集第二个洗脱峰A1B2C2,得人参蛋白GP1,其分子量范围在23~27kDa;(6).将样品A1 B1用pH＝4.0~6.0、0.01~0.03mol/L醋酸铵-醋酸缓冲液透析,透析保留液于1~10℃以10000~15000r/min离心5~15min、上清液经0.22~0.45μm滤膜过滤后上样于用此缓冲液平衡好的SP-SepharoseFF离子交换柱,用缓冲液洗柱直至样品的280nm处吸收峰回到基线,再用含0~1mol/L NaCl的此缓冲液进行盐梯度洗脱,流速为0.1~3.0ml/min,收集未吸附样品A1B1C1,收集第一个洗脱峰A1B1C2,得人参蛋白GP2,其分子量范围在60~70kDa,并收集第二个洗脱峰A1B1C3;(7).将样品A1B1C1用pH＝7~8、0.01~0.03mol/LTris-HCl缓冲液透析,透析保留液于1~10℃以10000~15000r/min离心5~15min、上清液经0.22~0.45μm滤膜过滤后上样于用此缓冲液平衡好的DEAE-Sepharose FF离子交换柱,洗柱直至280nm处吸收峰回到基线,用含0~1mol/L NaCl的此缓冲液进行盐梯度洗脱,流速为0.1~3ml/min,得到第一个洗脱峰A1B1C1D1,为人参蛋白GP3,其分子量范围在10~20kDa;(8).将样品A1B1C3用含1~2mol/L硫酸铵的pH＝7~8、0.01~0.03mol/LTris-HCl缓冲液透析,透析保留液于1~10℃以10000~15000r/min离心5~15min、上清液经0.22~0.45μm滤膜过滤后上样于用此缓冲液平衡好的Phenyl Sepharose 6 FF疏水层析柱,用缓冲液洗柱直至样品的280nm处吸收峰回到基线,流速为0.1~3ml/min,得到未吸附部分A1B1C3D1,为人参蛋白GP4,其分子量范围在60~70kDa;(9).将样品A2上样于用pH＝7~8、0.01~0.03mol/L Tris-HCl缓冲液平衡好的Sephadex G-25凝胶过滤层析柱,用此缓冲液洗脱至样品的280nm处吸收峰回到基线,流速为0.1~3ml/min,得到第一个洗脱峰A2B1,为人参蛋白GP5,其分子量范围在5~10kDa;(10).收集上述各步骤获得的人参蛋白样品GP1~GP5,分别经过pH＝7~8、0.01~0.03mol/L Tris-HCl缓冲液1~10℃透析12~36h,透析袋截留分子量范围为6000~8000Da,透析保留液再于1~10℃、3000~10000r/min离心10~60min,取上清液冷冻干燥后即得人参水溶性蛋白.