• 检测基因Ⅳ型戊型肝炎病毒抗体的间接ELISA方法

    • 摘要:

      本发明公开了一种检测基因Ⅳ型戊型肝炎病毒抗体的间接ELISA方法,步骤包括:1)构建重组表达质粒pET42a?ORF3,将pMD18T?ORF3质粒和pET42a(+)原核表达载体转化DH5a感受态细胞,涂布于LB固体培养基上过夜;挑取单菌落接种于LB培养液中过夜;36小时后离心,收集菌体,提取质粒DNA;在连接酶的作用下,将双酶切后的ORF3片段与pET42a(+)原核表达载体进行连接,获得重组表达质粒pET42a?ORF3;2)对重组表达质粒pET42a?ORF3诱导表达和纯化;3)得到成功表达了His/GST?ORF3融合蛋白,即可用于血清学调查.本发明的方法,成本低,准确率高.

    • 专利类型:

      发明专利

    • 申请/专利号:

      CN201610703423.9

    • 申请日期:

      2016.08.23

    • 公开/公告号:

      CN106093385A

    • 公开/公告日:

      2016-11-09

    • 发明人:

      王凤阳 杜丽 赵天靖 聂鑫

    • 申请人:

      海南大学

    • 主分类号:

      G01N33/569(2006.01)I,G,G01,G01N,G01N33

    • 分类号:

      G01N33/569(2006.01)I,C12N15/70(2006.01)I,C07K14/08(2006.01)I,G,C,G01,C12,C07,G01N,C12N,C07K,G01N33,C12N15,C07K14,G01N33/569,C12N15/70,C07K14/08

    • 主权项:

      一种检测基因Ⅳ型戊型肝炎病毒抗体的间接ELISA方法,其特征在于,按照以下步骤实施:步骤1、构建重组表达质粒pET42a?ORF3将pMD18T?ORF3质粒和pET42a(+)原核表达载体转化DH5a感受态细胞,取50uL菌液涂布于LB固体培养基上,37℃倒置培养过夜;12小时后,挑取单菌落接种于3mL的LB培养液中,37℃振荡过夜;36小时后,在12000rpm状态下离心2分钟,收集菌体,提取质粒DNA;对pMD18T?ORF3质粒和pET42a(+)原核表达载体采用EcoR?Ⅰ和Sal?Ⅰ进行双酶切,在T4?DNA?ligase连接酶的作用下,将双酶切后的ORF3片段与pET42a(+)原核表达载体进行连接,获得重组表达质粒pET42a?ORF3;步骤2、对重组表达质粒pET42a?ORF3诱导表达和纯化将正确插入目的基因的重组表达质粒pET42a?ORF3转化大肠杆菌BL21感受态细胞,挑取单菌落,同时设转化空载体质粒的大肠杆菌BL21为对照,置于5mL的LB培养液中,37℃振摇过夜;12小时后,将其以1:100的比例振摇培养至OD600=0.4?0.6时,无菌取出lmL菌液作为诱导前对照,给剩余的菌液中加入IPTG至终浓度为1mmol/L,30℃继续振摇培养4小时,在12000rpm状态下离心1分钟收集菌体;弃上清,沉淀加入等体积的2倍样品缓冲液,充分混匀,沸水中加热5分钟,在12000rpm状态下离心1分钟;取上清,以未诱导菌体为对照,进行SDS?PAGE电泳检测;对表达条件进行优化,确定诱导表达的最佳条件;步骤3、利用镍离子亲和层析柱纯化His/GST?ORF3融合蛋白,分别收集洗脱液,取各部分样品进行SDS?PAGE分析,观察蛋白纯化效果,得到成功表达了His/GST?ORF3融合蛋白,即可用于血清学调查.