• 污水处理厂活性污泥中自养菌与异养菌的分离方法

    • 摘要:

      一种污水处理厂活性污泥中自养菌与异养菌的分离方法,属于污水生物处理技术领域.本发明可以分离污水处理厂活性污泥中对碳源种类需求不同的自养菌与异养菌的DNA,从基因水平上分析两种菌群的特点.采用13C标记的无机物或有机物作为碳源原位培养污水厂活性污泥,采用稳定性高、分离效果好的氯化铯超高速密度梯度离心法分离得到不同层级的DNA溶液.分离之后各层级溶液的密度按照离心管从下到上的方向对应从大到小减少.采用实时定量PCR技术和高通量测序技术分析5‑9层级的DNA样品的微生物群落特征.本发明提供了一种经济、简便、可靠的污水处理厂活性污泥中自养菌与异养菌DNA的分离方法.

    • 专利类型:

      发明专利

    • 申请/专利号:

      CN201710011997.4

    • 申请日期:

      2017.01.08

    • 公开/公告号:

      CN106701580A

    • 公开/公告日:

      2017-05-24

    • 发明人:

      曾薇 郭瑜 李宁 彭永臻

    • 申请人:

      北京工业大学

    • 主分类号:

      C12N1/02(2006.01)I,C,C12,C12N,C12N1

    • 分类号:

      C12N1/02(2006.01)I,C12Q1/68(2006.01)I,C02F3/34(2006.01)I,C,C12,C02,C12N,C12Q,C02F,C12N1,C12Q1,C02F3,C12N1/02,C12Q1/68,C02F3/34

    • 主权项:

      一种污水处理厂活性污泥中自养菌与异养菌的分离方法,其特征在于:分离自养菌时,将活性污泥混合液均分为两份,一份中加入13C标记的无机物作为实验组,另一份中加入12C标记的无机物作为对照组,分别原位培养;分离异养菌时,将活性污泥混合液均分为两份,一份中加入13C标记的有机物作为实验组,另一份中加入12C标记的有机物作为对照组,分别原位培养;提取培养后活性污泥微生物的基因组DNA;将DNA样品与氯化铯溶液混合并进行超高速密度梯度离心;采用重力法在离心管的顶部匀速注水,在离心管底部接收流出的离心液,分离得到不同密度层级的DNA溶液;用PEG6000和乙醇溶液纯化各层级的DNA样品;利用普通PCR技术、实时定量PCR技术和高通量测序技术测定分离后实验组中5‑9层级的DNA样品,分析自养或异养微生物的群落特征,并与对照组进行比较;上述超高速密度梯度离心过程如下:(1)用分光光度计测定原位培养后活性污泥微生物的基因组DNA;(2)采用Gradient Buffer缓冲液将2.0μg的活性污泥基因组DNA定容到100μL;(3)在15mL的离心管中,依次加入4.9mL浓度为1.85g/mL的CsCl溶液、0.9mL Gradient Buffer缓冲液和步骤(2)中得到的100μL含2.0μg活性污泥DNA的溶液;(4)采用涡旋振荡仪将上述溶液完全混合;(5)采用折光仪测定折光率,使上述溶液的目标折射率为1.4029±0.0002,这一折射率对应的浮力密度为1.725g/mL,如果目标折射率偏大,添加Gradient Buffer缓冲液,20μL为一个添加单位;如果目标折射率偏小,添加1.85g/mL的CsCl溶液,20μL为一个添加单位;(6)采用10mL注射器移取步骤(5)的溶液5.1mL至6mL的离心管中,密封离心管;(7)将离心试管放入超高速离心转子,并使用螺帽将试管密封于转子中;超高速离心的基本参数是:44小时;20℃;速度45krpm或190000*g;Time:hold;Accel:9;Decel:no break;(8)离心完成后,将离心后的超高速密度梯度离心管固定于三脚架上,在超高速离心管底部放置15个1.5mL离心管,用6号针头在超高速离心管底部扎一个小孔,然后在试管顶部未填充离心溶液的空隙处,将另外一个6号针头插入并把它与固定流速泵相连,随后启动固定流速泵;固定流速泵的流速设置为340μL/min;启动固定流速泵后,从离心管底部第一滴溶液流出开始计时,每隔1min更新放置于超高速离心管底部的1.5mL离心管的位置;均匀收集从超高速离心管流出的不同密度层级的DNA,得到15个不同密度层级的DNA用于后续分析;上述各层级的DNA样品的纯化步骤如下:(1)利用折光仪测定15层液体每层的折光率,评价分层效果;通过离心溶液密度计算的经验公式ρ=‑75.9318+99.2031x‑31.2551x2,推导各层液体的浮力密度,上述公式中ρ表示浮力密度,x表示折光值,使浮力密度的范围在1.690~1.760g/mL之间;(2)每层中加入550μL的PEG6000溶液,头尾倒置若干次混匀溶液,室温静置2h或37℃加热1h,沉淀DNA;(3)在15‑20℃下13000*g高速离心30min,除去上清液;(4)加入500μL质量百分比为70%乙醇清洗DNA沉淀,离心10min,除去上清液;(5)再次加入500μL质量百分比为70%乙醇清洗DNA沉淀,离心10min,除去上清液;(6)将沉淀的DNA室温干燥15min;(7)确保DNA沉淀中无液体存在后,将其溶于30μL TE缓冲液,零下20℃保存.