筛选醛糖还原酶抑制剂的方法

• 摘要：

  筛选醛糖还原酶抑制剂的方法,解决了现有技术中光谱法易受背景干扰,引起假阳性和假阴性结果的问题.本发明以葡萄糖为底物,醛糖还原酶在25-37摄氏度催化葡萄糖生成山梨醇,用超高效液相色谱和质谱联用对山梨醇进行定量,进一步计算出天然产物提取物、单体及合成类的醛糖还原酶抑制剂对醛糖还原酶的抑制率.本发明的筛选方法快速、准确,线性方程相关系数达到0.999,可用于醛糖还原酶抑制剂的筛选及醛糖还原酶的动力学研究.

• 专利类型：

  发明专利

• 申请/专利号：

  CN201210284802.0

• 申请日期：

  2012.08.10

• 公开/公告号：

  CN102796802A

• 公开/公告日：

  2012-11-28

• 发明人：

  宋凤瑞 侯广月 刘舒 皮子凤 刘志强 刘淑莹

• 申请人：

  中国科学院长春应用化学研究所

• 主分类号：

  C12Q1/26(2006.01)I,C,C12,C12Q,C12Q1

• 分类号：

  C12Q1/26(2006.01)I,G01N30/02(2006.01)I,G01N27/62(2006.01)I,C,G,C12,G01,C12Q,G01N,C12Q1,G01N30,G01N27,C12Q1/26,G01N30/02,G01N27/62

• 主权项：

  筛选醛糖还原酶抑制剂的方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)酶促反应缓冲液的配制缓冲液是pH值为6.0?6.4的醋酸铵水溶液;(2)标准品的配制将山梨醇分别配成浓度为0.1微摩尔/升、0.2微摩尔/升、0.5微摩尔/升、1微摩尔/升、2微摩尔/升、5微摩尔/升、10微摩尔/升、20微摩尔/升、50微摩尔/升的标准品溶液,且每个浓度的标准品溶液均含1微摩尔/升的木糖醇作为内标;(3)空白样品和样品的酶促反应空白样品:反应总体积200微升,含有体积为30微升的醛糖还原酶、终浓度5毫摩尔/升的2?巯基乙醇、终浓度150微摩尔/升的NADPH、终浓度10毫摩尔/升的底物葡萄糖,其余以缓冲液补足;样品:反应总体积200微升,含有体积为30微升的醛糖还原酶、终浓度5毫摩尔/升的2?巯基乙醇、终浓度150微摩尔/升的NADPH、终浓度0.1?50微摩尔/升的待测物、终浓度10毫摩尔/升的底物葡萄糖,其余以缓冲液补足;空白样品和样品在25?40摄氏度反应15?40分钟,分别加入甲醇或乙腈终止反应,分别加入终浓度为1微摩尔/升的内标木糖醇;(4)标准品、空白样品和样品的检测对(2)中的标准品进行超高效液相色谱和质谱检测,从总离子流图中提取山梨醇和木糖醇的色谱图,分别积分求峰面积,以标准品浓度为横坐标,以山梨醇与木糖醇峰面积比值为纵坐标,或以标准品浓度为纵坐标,以山梨醇与木糖醇的峰面积比值为横坐标,得到山梨醇浓度的线性方程;对空白样品、样品溶液进行超高效液相色谱和质谱检测;所述的超高效液相色谱的检测条件:色谱柱:?Waters?ACQUITY?UPLC?BEH??C18??2.1*50毫米,1.7微米;流动相:甲醇和水;?等度洗脱程序:0?2?分钟,20%甲醇,所指的百分比均为体积百分比;流速:0.2毫升/分钟;进样量:3微升;所述的质谱检测条件:毛细管电压:3000伏特;去溶剂气氮气温度:350摄氏度;锥孔电压:14伏特;去溶剂气氮气流速:800升/小时;锥孔气氮气流速:60升/小时;碰撞气氩气流速:0.15毫升/分钟;(5)待测物对醛糖还原酶的抑制率分别计算空白样品、样品中山梨醇峰面积和内标木糖醇峰面积的比值,根据(4)得到的线性方程,求得空白样品和样品中山梨醇的浓度,计算出待测物对醛糖还原酶的抑制率.