基于二氧化硅纳米粒子的DNA硅纳米水凝胶的构建方法及比率型检测细胞内ATP的方法

• 摘要：

  本申请公开了基于二氧化硅纳米粒子的DNA硅纳米水凝胶的构建方法及其比率型检测细胞内ATP的方法,构建方法包括三个步骤,分别是硅纳米粒子‑甲基丙烯酸(MAA)‑DNA 1结构的构建;甲基丙烯酸(MAA)‑DNA 2结构的构建;DNA‑硅纳米水凝胶的合成;检测细胞内ATP的方法包括两个步骤:包括细胞培养和细胞成像.本发明使用二氧化硅纳米粒子,建立了一种DNA‑硅纳米水凝胶.不同于一般的金属纳米粒子,二氧化硅纳米粒子具有良好的生物相容性,及稳定性,使得DNA‑硅纳米水凝胶具有更低的毒性.

• 专利类型：

  发明专利

• 申请/专利号：

  CN201910088438.2

• 申请日期：

  2019.01.18

• 公开/公告号：

  CN109781688A

• 公开/公告日：

  2019-05-21

• 发明人：

  丁彩凤 王晶 纪小婷 王俊宁

• 申请人：

  青岛科技大学

• 主分类号：

  G01N21/64(2006.01),G,G01,G01N,G01N21

• 分类号：

  G01N21/64(2006.01),G01N1/28(2006.01),G,G01,G01N,G01N21,G01N1,G01N21/64,G01N1/28

• 主权项：

  1.基于二氧化硅纳米粒子的DNA硅纳米水凝胶的构建方法,其特征是:包括硅纳米粒子-甲基丙烯酸-DNA 1结构的构建、甲基丙烯酸-DNA 2结构的构建和DNA-硅纳米水凝胶的合成, 所述硅纳米粒子-甲基丙烯酸(MAA)-DNA 1结构的构建: S1、硅纳米粒子、DNA 1链及甲基丙烯酸的活化:取23.5μL 1*10-5M的DNA 1加入离心管中,加入取10μL 4.78*10-3M的N-羟基琥珀酰亚胺对DNA 1进行活化,活化时间为30min,同时取21μL 1.17*10-4M的甲基丙烯酸置于离心管中,加入10μL 1.04*10-3M的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐对甲基丙烯酸活化30min,取10μL硅纳米粒子于离心管中,加入10μL 4.78*10-3M的N-羟基琥珀酰亚胺活化30min; S2、硅纳米粒子、DNA 1链及甲基丙烯酸的链接:将S1中活化好的甲基丙烯酸与活化好的DNA 1链在试管中混合,摇晃3min,然后放置在4℃环境中,反应12h,得到产物A,将产物A加入到S1中已经活化好的硅纳米粒子中继续反应,放置在4℃环境中,反应12h,得到产物Ⅰ; 所述甲基丙烯酸-DNA 2结构的构建; S3、DNA 2链及甲基丙烯酸的活化:取52.15μL 1*10-5M的DNA 2加入离心管中,加入取10μL 4.78*10-3M的N-羟基琥珀酰亚胺对DNA 2进行活化,活化时间为30min,同时取4.01μL1.17*10-2M的甲基丙烯酸于离心管中,加入10μL 1.04*10-3M的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐进行活化,活化30min; S4、DNA 2链及甲基丙烯酸的链接:将活化好的甲基丙烯酸与活化好的DNA 2链混合,放置在4℃环境中,反应12h,得到产物Ⅱ,备用; 所述DNA-硅纳米水凝胶的合成; S5、将所得产物Ⅱ加入10μL 1％的Irgacure2959,100μL的缓冲溶液和346.5μL的去离子水,混合均匀后,放置在365nm紫外光下照射30min,得到产物Ⅲ,备用; S6、将所得产物Ⅱ加入4μL 1％的Irgacure2959,20μL的缓冲溶液和119.85μL的去离子水,混合均匀后,放置在365nm紫外光下照射30min,得到产物Ⅳ,备用; S7、将所得产物Ⅲ、产物Ⅳ和1*10-5M的Linker按照比例加入,放入95℃的水浴锅中退火5min后,放入冰水浴中反应2-4h. 2.根据权利要求1所述的一种基于二氧化硅纳米粒子的DNA硅纳米水凝胶的构建方法,其特征是:所述缓冲溶液为100mM Tris-HCl 500mM NaCl 100mM MgCl2. 3.根据权利要求1所述的一种基于二氧化硅纳米粒子的DNA硅纳米水凝胶的构建方法,其特征是:所述S7中的产物Ⅲ、产物Ⅳ和Linker的比例为100:19.58:4.7. 4.一种基于二氧化硅纳米粒子的DNA硅纳米水凝胶的比率型检测细胞内ATP的方法,其特征是:包括细胞培养和细胞成像,所述细胞培养为在细胞培养皿中加入血清浓度为10％的1640细胞培养液进行细胞培养,将制备好的DNA-硅纳米水凝胶加入到培养皿中,充分混匀后,置于37℃,5％的二氧化碳培养箱中,培养1-5h. 所述细胞成像包括以下两个步骤: A1、取出培养1-5h后的细胞培养皿,倒掉混合培养液,再向培养皿中加入1640培养液,重复冲洗,最后,加入1mL含有10％血清的培养液,待用, A2、在激光共聚焦显微镜下观察细胞内FAM和Cy3的荧光,以488nm为激发光源,采集520nm与565nm的发射光,明显观测到:细胞中有较强的Cy3红色荧光,随着时间的推移,可以清楚看到红色荧光越来越弱,绿色荧光越来越强,表明此DNA-硅纳米水凝胶具有良好的检测ATP的效果.