一种高效创制磺酰脲类除草剂抗性玉米的方法及其应用

• 摘要：

  本发明涉及植物基因工程技术领域,具体涉及一种高效创制磺酰脲类除草剂抗性玉米的方法及其应用.本发明提供特异性靶向玉米ALS1和ALS2基因的sgRNA、含有该sgRNA的CRISPR/Cas9基因组单碱基编辑载体,以及利用该载体进行精确目标DNA定点替换突变创制磺酰脲类除草剂抗性玉米种质的方法.本发明提供的单碱基编辑载体能够实现较高的ALS1和ALS2基因的单碱基突变效率,显著提高了ALS1和ALS2基因定点纯合替换以及磺酰脲类除草剂抗性玉米制备的效率,制备得到的磺酰脲类除草剂抗性玉米可耐受300mg/L的氯磺隆除草剂喷施处理,具有很高的育种和栽培价值.

• 专利类型：

  发明专利

• 申请/专利号：

  CN201910709006.9

• 申请日期：

  2019.08.01

• 公开/公告号：

  CN110373414A

• 公开/公告日：

  2019-10-25

• 发明人：

  谢传晓 李燕敏 朱金洁 刘昌林 黄长玲 李新海 李文学 李明顺

• 申请人：

  中国农业科学院作物科学研究所

• 主分类号：

  C12N15/113(2010.01),C,C12,C12N,C12N15

• 分类号：

  C12N15/113(2010.01),C12N15/82(2006.01),C12N5/10(2006.01),A01H4/00(2006.01),A01H5/00(2018.01),A01H6/46(2018.01),C,A,C12,A01,C12N,A01H,C12N15,C12N5,A01H4,A01H5,A01H6,C12N15/113,C12N15/82,C12N5/10,A01H4/00,A01H5/00,A01H6/46

• 主权项：

  1.特异性靶向玉米ALS1基因和ALS2基因的sgRNA,其特征在于,其识别ALS1基因或ALS2基因的靶位点序列如SEQ ID NO.1所示. 2.根据权利要求1所述的特异性靶向玉米ALS1基因和ALS2基因的sgRNA,其特征在于,其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示. 3.含有权利要求1或2所述的特异性靶向玉米ALS1基因和ALS2基因的sgRNA的CRISPR/Cas9基因组单碱基编辑载体. 4.根据权利要求3所述的CRISPR/Cas9基因组单碱基编辑载体,其特征在于,所述sgRNA由RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子驱动转录; 优选地,所述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子为ZmPolⅢca99启动子,所述ZmPolⅢca99启动子是下述a)或b)或c)的DNA片段: a)SEQ ID NO.3所示的DNA分子; b)与a)限定的DNA序列具有75％或75％以上的同源性,且具有启动子功能的DNA分子; c)在严格条件下与a)或b)限定的DNA序列杂交,且具有启动子功能的DNA分子. 5.根据权利要求3或4所述的CRISPR/Cas9基因组单碱基编辑载体,其特征在于,所述载体还包含胞嘧啶脱氨酶、Cas9切口酶和糖基化酶抑制子; 优选地,所述胞嘧啶脱氨酶由ubiquitin启动子驱动转录;和/或,所述Cas9切口酶由ubiquitin启动子驱动转录;和/或,所述糖基化酶抑制子由ubiquitin启动子驱动转录; 更优选地,所述胞嘧啶脱氨酶、Cas9切口酶和糖基化酶抑制子的转录由ubiquitin启动子共同驱动;所述胞嘧啶脱氨酶、Cas9切口酶和糖基化酶抑制子的转录由NOS终止子终止. 6.根据权利要求3~5任一项所述的CRISPR/Cas9基因组单碱基编辑载体,其特征在于,所述载体的序列如SEQ ID NO.4所示. 7.权利要求1或2所述的sgRNA或权利要求3~6任一项所述的CRISPR/Cas9基因组单碱基编辑载体在玉米基因组ALS1和/或ALS2基因单碱基编辑或在培育磺酰脲类除草剂抗性玉米中的应用. 8.一种制备基因组ALS1基因和/或ALS2基因突变的玉米细胞的方法,其特征在于,将权利要求3~6任一项所述的CRISPR/Cas9基因组单碱基编辑载体导入玉米细胞,构建基因组ALS1的第165位氨基酸突变,和/或,基因组ALS2的第165位氨基酸突变的玉米细胞. 9.一种制备磺酰脲类除草剂抗性玉米的方法,其特征在于,利用权利要求3~6任一项所述的CRISPR/Cas9基因组单碱基编辑载体将玉米基因组ALS1的第165位氨基酸突变,和/或,将玉米基因组ALS2基因的第165位氨基酸突变. 10.根据权利要求9所述的制备磺酰脲类除草剂抗性玉米的方法,其特征在于,包括如下步骤: (1)将权利要求3~6任一项所述的CRISPR/Cas9基因组单碱基编辑载体转化至农杆菌,构建重组农杆菌; (2)将所述重组农杆菌诱导转化至玉米愈伤组织中,获得玉米再分化植株; (3)经筛选、鉴定获得将玉米基因组ALS1基因的第165位氨基酸突变,和/或,将玉米基因组ALS2基因的第165位氨基酸突变的突变玉米植株; 优选地,在步骤(3)得到的突变玉米植株的分离世代中筛选获得去除转基因成分的无转基因成分的突变玉米植株.