一种烯酸还原酶的突变体蛋白及其应用

• 摘要：

  本发明涉及一种烯酸还原酶的突变体蛋白及其应用.该烯酸还原酶的突变体蛋白是基于由凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans 36D1)烯酸还原酶基因,运用易错PCR与半理性设计方法,通过随机突变与定点突变,经定向进化而获得;当该序列包含位于野生型ER‑BC的如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的沿5′端到3′端方向的氨基酸突变子p.Ser109Asn、p.Gly111Asp、p.Leu181Pro、p.Ile187Asn、p.Phe207Tyr、p.Phe229Ile、p.Gly531Ser中的一个或几个时,该烯酸还原酶突变体的酶活力较出发菌株呈现显著提高.

• 专利类型：

  发明专利

• 申请/专利号：

  CN201911002963.4

• 申请日期：

  2019.10.21

• 公开/公告号：

  CN110713990A

• 公开/公告日：

  2020-01-21

• 发明人：

  谭天伟 李小芳 陈必强 张世鼎

• 申请人：

  北京化工大学

• 主分类号：

  C12N9/02(2006.01),C,C12,C12N,C12N9

• 分类号：

  C12N9/02(2006.01),C12N15/53(2006.01),C12P7/44(2006.01),C,C12,C12N,C12P,C12N9,C12N15,C12P7,C12N9/02,C12N15/53,C12P7/44

• 主权项：

  1.一种影响烯酸还原酶酶活力的氨基酸突变子,其包括位于野生型ER-BC的如SEQ IDNO 1所示的氨基酸序列从N端到C端方向的第109位Ser与Asn的突变、第111位Gly与Asp的突变、第181位Leu与Pro的突变、第187位Ile与Asn的突变、第207位Phe与Tyr的突变、第229位Phe与Ile的突变、第531位Gly与Ser的突变中的一个或几个. 2.一种烯酸还原酶的突变体蛋白,其序列包含位于野生型ER-BC的如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列从N端到C端方向的第109位Ser与Asn的突变、第111位Gly与Asp的突变、第181位Leu与Pro的突变、第187位Ile与Asn的突变、第207位Phe与Tyr的突变、第229位Phe与Ile的突变、第531位Gly与Ser的突变中的一个或几个. 3.根据权利要求2所述的烯酸还原酶的突变体蛋白,其特征在于, 所述突变体蛋白为1号ER-BC突变体蛋白,其序列中包含位于野生型ER-BC的如SEQ IDNO 1所示的氨基酸序列从N端到C端方向的第181位Leu与Pro的突变、第187位Ile与Asn的突变、第207位Phe与Tyr的突变、第229位Phe与Ile的突变;优选地,所述1号ER-BC突变体蛋白的序列如SEQ ID NO 2所示; 和/或,所述突变体蛋白为2号ER-BC突变体蛋白,其序列包含位于野生型ER-BC的如SEQID NO 1所示的氨基酸序列从N端到C端方向的第111位Gly与Asp的突变、第531位Gly与Ser的突变;优选地,所述2号ER-BC突变体蛋白的序列如SEQ ID NO3所示; 和/或,所述突变体蛋白为3号ER-BC突变体蛋白,其序列包含位于野生型ER-BC的如SEQID NO 1所示的氨基酸序列从N端到C端方向的第111位Gly与Asp的突变、第181位Leu与Pro的突变;优选地,所述3号ER-BC突变体蛋白的序列如SEQ ID NO4所示; 和/或,所述突变体蛋白为4号ER-BC突变体蛋白,其序列包含位于野生型ER-BC的如SEQID NO 1所示的氨基酸序列从N端到C端方向的第109位Ser与Asn的突变、第111位Gly与Asp的突变、第181位Leu与Pro的突变;优选地,所述4号ER-BC突变体蛋白的序列如SEQ ID NO5所示; 优选地,所述突变体蛋白还包括上述ER-BC突变体蛋白的N端或C端连接标签得到的融合蛋白;优选地,所述突变体蛋白还包括由1号ER-BC突变体蛋白、2号ER-BC突变体蛋白、3号ER-BC突变体蛋白或4号ER-BC突变体蛋白的N端或C端连接His标签得到的融合蛋白. 4.一种影响烯酸还原酶酶活力的核苷酸突变子,其包括位于编码野生型ER-BC的如SEQID NO 1所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO 6所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第325位T与A的突变、第326位C与A的突变、第332位G与A的突变、第542位T与C的突变、第560位T与A的突变、第620位T与A的突变、第685位T与A的突变、第1591位G与A的突变中的一个或几个. 5.一种编码权利要求2或3所述的突变体蛋白的核苷酸分子,其序列中包含位于编码野生型ER-BC的如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO 6所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第325位T与A的突变、第326位C与A的突变、第332位G与A的突变、第542位T与C的突变、第560位T与A的突变、第620位T与A的突变、第685位T与A的突变、第1591位G与A的突变中的一个或几个. 6.根据权利要求5所述的核苷酸分子,其特征在于,所述核苷酸分子为编码1号ER-BC突变体蛋白的核苷酸分子,其序列中包含位于编码野生型ER-BC的如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO 6所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第542位T与C的突变、第560位T与A的突变、第620位T与A的突变、第685位T与A的突变;优选地,所述编码1号ER-BC突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO 7所示; 和/或,所述核苷酸分子为编码2号ER-BC突变体蛋白的核苷酸分子,其序列中包含位于编码野生型ER-BC的如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO 6所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第332位G与A的突变、第1591位G与A;优选地,所述编码2号ER-BC突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO 8所示; 和/或,所述核苷酸分子为编码3号ER-BC突变体蛋白的核苷酸分子,其序列中包含位于编码野生型ER-BC的如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO 6所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第332位G与A的突变、第542位T与C的突变;优选地,所述编码3号ER-BC突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO 9所示; 和/或,所述核苷酸分子为编码4号ER-BC突变体蛋白的核苷酸分子,其序列中包含位于编码野生型ER-BC的如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的如SEQ ID NO 6所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第325位T与A的突变、第326位C与A的突变、第332位G与A的突变、第542位T与C的突变;优选地,所述编码4号ER-BC突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO10所示. 7.根据权利要求6所述的核苷酸分子,其特征在于,所述核酸分子为如下DNA分子: (a1)编码区包括如SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10所示的核苷酸序列的DNA分子; (a2)核苷酸序列如SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10所示的DNA分子; (a3)与(a1)或(a2)中所述的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性,且编码权利要求3中的所述的蛋白质的DNA分子; (a4)在严格条件下与(a1)或(a2)中所述的核苷酸序列杂交,且编码权利要求3中的所述的蛋白质的DNA分子. 8.一种含有权利要求5-7中任意一项所述的核苷酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物. 9.一种如权利要求2或3所述的突变体蛋白的同源建模所得蛋白分子三维结构模型. 10.如权利要求2或3所述的突变体蛋白或由权利要求5-7中任意一项所述的核苷酸分子或如权利要求8所述的表达盒、重组载体或重组微生物制得的突变体蛋白在催化还原烯酸类物质中的应用;优选地,所述应用包括催化还原烯酸类物质、提高催化还原烯酸类物质产量、提高烯酸还原酶ER-BC催化效率,和催化还原2-烯己二酸生成己二酸.