一种抗西马特罗单克隆抗体及其应用

• 摘要：

  本发明提供一种抗西马特罗单克隆抗体及其应用,包括一种制备抗西马特罗单克隆抗体的方法,还包括制备西马特罗抗原工作液和制备西马特罗单克隆抗体两个内容,还提供抗西马特罗单克隆抗体的具体应用,包括制备ELISA试剂盒或胶体金层析试纸条.本发明制备的完全抗原具有很好的免疫原性,制备高效稳定的单克隆抗体,获得通过检测系列稀释的标准溶液将单抗的高度特异性和方法的高度敏感性有机地结合起来,达到抗原快速检测,适宜于短时间内检测大量样品,为样品中西马特罗残留的检测奠定了基础.

• 专利类型：

  发明专利

• 申请/专利号：

  CN202010047965.1

• 申请日期：

  2020.01.16

• 公开/公告号：

  CN111154000A

• 公开/公告日：

  2020-05-15

• 发明人：

  王选年 司艳芳 岳锋 郭东光 齐永华 潘鹏涛

• 申请人：

  新乡学院

• 主分类号：

  C07K16/44(2006.01),C,C07,C07K,C07K16

• 分类号：

  C07K16/44(2006.01),C07K14/77(2006.01),G01N33/577(2006.01),C12N15/06(2006.01),G01N33/535(2006.01),C,G,C07,G01,C12,C07K,G01N,C12N,C07K16,C07K14,G01N33,C12N15,C07K16/44,C07K14/77,G01N33/577,C12N15/06,G01N33/535

• 主权项：

  1.一种抗西马特罗单克隆抗体,其特征在于:所述抗体效价为1:64000,亚型为IgG1,对西马特罗的半数抑制浓度IC50为0.3ng/mL ,最低检测限为0.001ng/mL,与盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、盐酸多巴胺、溴布特罗、班布特罗、齐帕特罗、特布他林、达氟沙星、泰乐菌素无交叉反应. 2.一种制备如权利要求1所述的一种抗西马特罗单克隆抗体的方法,包括以下步骤: (1)制备西马特罗抗原工作液: (a)西马特罗重氮化:浓盐酸溶液提前放置冰上预冷30分钟后,将4mg西马特罗标准品溶于0.1mol/L PH=2的浓盐酸溶液中混匀,向上述溶液匀速逐滴加入预冷的0.15mol/L的NaNO2溶液,在冰上避光操作,同时使用淀粉淀化钾试纸监控,直至试纸变成蓝紫色时停止加入,之后避光低温低速搅拌4~4.5 h,得到西马特罗反应液; (b)调西马特罗反应液PH:用1 mol/L 的NaOH溶液调步骤(a)西马特罗反应液PH,至PH=7.4 时停止,用尿素用来中和过量的NaNO2 ,用淀粉淀化钾试纸检测,试纸由深蓝变为浅蓝,即停止,低温备用; (c)制备西马特罗人工完全抗原:称取17mg BSA粉末溶于1mL PH=8.6的硼酸缓冲液得到蛋白溶液,将步骤(b)所得混合液逐滴加入到蛋白溶液中,放于4℃避光低速搅拌24小时后,将反应得到的亮黄色偶联产物在处理好的透析袋中放置PBS中,每间隔8小时换一次透析液,透析3天,得到西马特罗人工完全抗原,标记为CIM-BSA; (d)制备西马特罗包被原:称取17mg OVA粉末溶于1mL PH=8.6的硼酸缓冲液得到蛋白溶液,将步骤 (b) 所得混合液逐滴加入到蛋白溶液中,放于4℃避光低速搅拌24小时后,将反应得到的亮黄色偶联产物在处理好的透析袋中放置OVA中,每间隔8小时换一次透析液,透析3天,得到西马特罗人工完全抗原,标记为CIM-OVA; (2)制备西马特罗单克隆抗体: (e)动物免疫:免疫原选用CIM-BSA,CIM-BSA与弗氏完全佐剂充分乳化后形成免疫剂,取4-6周龄雌性BALB/c小鼠6只,每只每次采用免疫剂量为50ug,间隔2周免疫1次,3次免疫后断尾取血测定效价和抑制率,选择血清效价高且具有CIM抑制作用强的小鼠进行细胞融合; (f)饲养细胞、SP2/0细胞及脾细胞准备:融合前一天,选用健康状况良好的 5-6 周龄的BALB/c小鼠,小鼠脱颈处死,无菌条件下取小鼠腹腔细胞作为饲养细胞;融合前一周复苏SP2/0细胞;无菌手术开腹经加强免疫的 BALB/c小鼠,并取出脾脏,经研磨棒挤压、培养基冲洗、离心、重悬、计数,备用; (g)细胞融合:取步骤(f)选定的小鼠骨髓瘤SP2/0细胞和小鼠的脾细胞按1:5-1:10的比例进行融合,间接ELISA法测定上清液选取阳性高的孔,通过有限稀释法对阳性孔进行亚克隆,直到每个克隆孔上清均为阳性时定株; (h)单克隆抗体腹水纯化:选取个体较大的雌性BALB/c小鼠,采用体内诱生腹水法,大量制备腹水,并通过辛酸-硫酸铵沉淀纯化腹水,分成小管,-20℃保存,获得西马特罗单克隆抗体. 3.如权利要求1或2所述的抗西马特罗单克隆抗体用于配制检测生物样品中的西马特罗的非诊断目的检测产品中的应用. 4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述非诊断目的检测产品为ELISA试剂盒或胶体金层析试纸条. 5.一种检测西马特罗的ELISA试剂盒,其特征在于:所述试剂盒中含有如权利要求1或2所述的抗西马特罗的单克隆抗体. 6.一种检测西马特罗的胶体金层析试纸条,其特征在于:所述胶体金层析试纸条中含有如权利要求1或2所述的抗西马特罗的单克隆抗体. 7.如权利要求5所述的一种检测西马特罗的ELISA试剂盒,其特征在于,包括下述各组分: (a)包被有所述西马特罗人工完全抗原的酶标板,包被液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液; (b)含有所述西马特罗药物单克隆抗体的工作液; (c)酶标记物工作液:辣根过氧化物酶-羊抗鼠抗抗体; (d)西马特罗标准品溶液:采用梯度稀释法配制0、0.1 ng/mL 、0.3 ng/mL、0.9 ng/mL、2.7 ng/mL、8.1ng/mL、24.3ng/mL的西马特罗小分子标准品; (e)底物显色液A 液为过氧化脲溶液,底物显色液B 液为四甲基联苯胺溶液; (f)终止液为2mol/L 的硫酸溶液; (g)洗涤液为磷酸吐温缓冲液; (h)样本稀释液为含有5％脱脂奶粉的0.01mol/L pH 7.4 的磷酸缓冲液. 8.权利要求7所述的检测西马特罗的ELISA试剂盒的用于检测西马特罗药物残留中的应用,其特征在于,包括如下步骤: (a)样品前处理:对猪尿样品15000rpm,离心 10min,去除沉淀和杂质颗粒,抽取上清用于检测; (b)取样品添加值及利用本试剂盒计算检测值:取三个间接竞争ELISA实验中小分子标准品的浓度,即为样品添加值,同一份样品做三次重复实验,将得到的吸光值取平均数带入标准曲线中计算小分子的含量,即为检测值; (c)计算样品添加回收率:检测值与样品添加量的比值为回收率,三次实验回收率的平均值为试剂盒平均回收率,样品回收率为108.6%.