T细胞免疫检查点PD-1的适配体筛选、鉴定方法及抗肿瘤应用

• 摘要：

  本发明涉及一种T细胞免疫检查点PD‑1的适配体筛选、鉴定方法及抗肿瘤应用,包括以下步骤:1)干粉ss DNA文库的预处理;2)正筛选;3)反筛选;4)PCR扩增;5)单链DNA制备;6)多轮筛选;7)克隆与测序;8)流式细胞术检测;9)免疫荧光检测;10)检测及分离;11)切片;12)检测中Bi‑Apt的封闭性,本发明通过细胞筛选针对于PD‑1蛋白的适配体,采用将靶蛋白表达在细胞膜表面,通过自行构建293T细胞系实现对靶标分子PD‑1的稳定表达,选取T细胞并将其表面免疫抑制性靶点PD‑1进行封闭,在靶分子方面选择的是特异表达的PD‑1分子,完成整个筛选过程,本发明可以在人体抗肿瘤临床中试验应用,为人类对抗肿瘤的临床使用提供了一种很好的方法.

• 专利类型：

  发明专利

• 申请/专利号：

  CN201911400634.5

• 申请日期：

  2019.12.30

• 公开/公告号：

  CN111154765A

• 公开/公告日：

  2020-05-15

• 发明人：

  赵永祥 李大力 程亮 彭睿 钟莉娉

• 申请人：

  广西医科大学

• 主分类号：

  C12N15/115(2010.01),C,C12,C12N,C12N15

• 分类号：

  C12N15/115(2010.01),C12N15/10(2006.01),G01N33/68(2006.01),G01N33/53(2006.01),A61K31/7088(2006.01),A61P35/00(2006.01),C,G,A,C12,G01,A61,C12N,G01N,A61K,A61P,C12N15,G01N33,A61K31,A61P35,C12N15/115,C12N15/10,G01N33/68,G01N33/53,A61K31/7088,A61P35/00

• 主权项：

  1.一种T细胞免疫检查点PD-1的适配体筛选、鉴定方法,其特征在于:包括以下步骤: 1)干粉ss DNA文库的预处理:溶解后进行第一轮的筛选; 2)正筛选:共进行三轮的筛选之中展开的仅仅是正筛选; 3)反筛选:自第四轮的筛选起,在每一轮的正筛前把反筛选引进其中,对非特异性的结合完全去除,筛选后的细胞置于冰箱中保存; 4)PCR扩增:以上所述的筛选中,在每一轮都将能与靶细胞结合,且不能与反筛细胞结合产物筛选,第四轮开始的ss DNA文库加以扩增,把上一筛选产物当作是下一轮所需的PCR模板,每一轮的筛选进行3次PCR的扩增; 5)单链DNA制备:对dsDNA进行单链化,产物可置于-20 °C的环境下保存; 6)多轮筛选:重复上述步骤进行正筛选及反筛选,至文库富集达饱和的平台期; 7)克隆与测序:对产物实行PCR扩增反应,采用TA克隆测序,对测序结果进行整理分析,去除无效结果,比对分析有效的序列,选出同一家族中拥有共性的代表序列; 8)流式细胞术检测:采用用流式细胞仪检测,并对检测结果进行分析处理; 9)免疫荧光检测; 10)检测血液中Bi-Apt的敏感性:运用梯度离心的方法,对血液进行分离; 11)检测Bi-Apt与肝癌组织中浸润的T细胞的结合:采用石蜡切片方法,将组织切为极薄的组织片并连续切片; 12)检测Bi-Apt的封闭性. 2.根据权利要求1所述T细胞免疫检查点PD-1的适配体筛选、鉴定方法,其特征在于:所述TA克隆测序中的PD-1的适配体,是序列2条中的核苷酸序列中的任意一条或两条序列. 3.一种T细胞免疫检查点PD-1的适配体的应用,其特征在于:如权利要求1所述的T细胞免疫检查点PD-1的适配体在抗肿瘤临床中应用.