• 一种细胞内蛋白质复合物原位分析方法及其应用

    • 摘要:

      本发明涉及一种细胞内蛋白质复合物原位分析方法及其应用.在该方法中,利用包裹交联剂载体与细胞共同孵育,利用细胞内吞,载体将交联剂运送至细胞内特定部位,并且释放化学交联剂,从而使蛋白质复合物进行原位交联.随后,利用基于离子液体的蛋白质提取方法,提取蛋白质及其复合物,并进一步结合质谱技术,对细胞内蛋白质复合物进行原位分析.这一方法对于解析细胞内蛋白质复合物时空动态变化规律、理解生命过程、揭示疾病机制、筛选生物标志物以及寻找药物靶标具有重大意义.

    • 专利类型:

      发明专利

    • 申请/专利号:

      CN201910505153.4

    • 申请日期:

      2019.06.12

    • 公开/公告号:

      CN112083081A

    • 公开/公告日:

      2020-12-15

    • 发明人:

      张丽华 周雯 杨开广 陈玉宛 裴家琪 梁振 张玉奎

    • 申请人:

      中国科学院大连化学物理研究所

    • 主分类号:

      G01N30/02(2006.01),G,G01,G01N,G01N30

    • 分类号:

      G01N30/02(2006.01),G01N30/06(2006.01),G,G01,G01N,G01N30,G01N30/02,G01N30/06

    • 主权项:

      1.一种细胞内蛋白质复合物原位分析方法,其特征在于:包括以下步骤:(1)利用包裹交联剂载体与细胞共同孵育,利用细胞内吞,载体将交联剂运送至细胞内特定部位,并且释放交联剂,从而使蛋白质复合物进行原位交联;(2)利用基于离子液体的蛋白质提取方法,提取蛋白质及其复合物;(3)利用高分辨质谱对蛋白质及其蛋白质复合物进行分析. 2.如权利要求1所述一种细胞内蛋白质复合物原位分析方法,其特征在于:包裹交联剂载体包括以聚合物、复合材料和生物膜为基质的载体. 3.如权利要求1所述一种细胞内蛋白质复合物原位分析方法,其特征在于:所述交联剂包括:其两侧基团均为与蛋白上氨基反应的琥珀酰亚胺基团、卤代芳烃或亚胺酸酯;或均为与蛋白上巯基反应的马来酰亚胺基团、2-巯基吡啶、硫代磺酸盐、卤代乙酰基或吡啶基二硫化物;或均为与蛋白上羧基反应的碳化二亚胺或异氰酸盐;或均为与蛋白上糖链反应的酰肼基团;或均为与蛋白质中的氨基酸残基发生反应的非特异反应基团的苯基叠氮基团或双吖丙啶;所述的交联剂其两侧基团分别为上述任一反应基团. 4.如权利要求3所述一种细胞内蛋白质复合物原位分析方法,其特征在于:所述的琥珀酰亚胺基团为磺酸基-琥珀酰亚胺和羟基-琥珀酰亚胺中的一种或两种以上;所述的苯基叠氮基团为硝基苯叠氮基团和卤代苯叠氮基团中的一种或两种以上. 5.如权利要求1所述一种细胞内蛋白质复合物原位分析方法,其特征在于:所述的细胞内特定部位包括:细胞膜、细胞质、细胞核、线粒体、溶酶体、高尔基体、过氧化物酶体、内质网、胞内小体. 6.如权利要求1所述一种细胞内蛋白质复合物原位分析方法,其特征在于:所述的包裹交联剂载体与细胞共同孵育包括:载体与细胞在细胞培养液中共孵育1-12小时,并收集细胞. 7.如权利要求1所述一种细胞内蛋白质复合物原位分析方法,其特征在于:所述的基于离子液体的蛋白质提取方法,提取蛋白质及其复合物包括:(1)在收集的细胞中加入离子液体并提取蛋白质及其复合物,然后加入二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦,并进行高温变性,所述高温变性的温度为56℃-95℃;(2)将高温变性后的样品转移至滤膜上,利用碘代乙酰胺或N-乙基马来酰亚胺进行烷基化;(3)利用胰酶对蛋白质及其复合物进行膜上酶切,并利用离心收集肽段及其交联肽段样品. 8.如权利要求1所述一种细胞内蛋白质复合物原位分析方法,其特征在于:所述的利用高分辨质谱对蛋白质及其蛋白质复合物进行分析包括:蛋白质及其蛋白质复合物定性分析和/或定量分析过程采用液质联用,所述液质联用中的质谱为静电场轨道阱、飞行时间管和傅里叶变换质谱,利用高分辨质谱对蛋白质及其蛋白质复合物进行分析时,采用的检索数据库包括:Mascot,pFind和pLink. 9.根据权利要求1-8任一项所述的一种细胞内蛋白质复合物原位分析方法,其特征在于,所述的细胞包括:真核细胞、原核细胞和古核细胞. 10.一种如权利要求1-9任一项所述细胞内蛋白质复合物原位分析方法的应用,其特征在于,所述的细胞内蛋白质复合物原位分析方法应用于:细胞内原位蛋白复合体的规模化分析、细胞内亚细胞器蛋白质复合物规模化分析、细胞内原位目标蛋白质复合物分析、蛋白质的空间结构解析、蛋白质-蛋白质相互作用解析以及蛋白质时空动态变化分析.