植物免疫受体克隆新方法， 通过RLP/RLK富集测序快速定位植物膜上免疫受体

来源：植物科学最前沿

近日，New Phytologist杂志在线发表了荷兰瓦赫宁根大学大学和研究中心（Wageningen UR）植物育种组和苏格兰The James Hutton研究所合作的题为“RLP/K enrichment sequencing; a novel method to identify receptor‐like protein (RLP) and receptor‐like kinase (RLK) genes”的研究论文。

植物免疫受体主要由细胞内的NBS-LRR蛋白以及膜上的RLP或者RLK蛋白组成。其中NBS-LRR蛋白可以识别病原菌分泌到植物胞内的效应子蛋白(Effector), 从而激发效应子触发的免疫反应(ETI)；而膜上的RLP/K蛋白可以识别病原菌分泌到胞外的PAMP或者胞外效应子 (Apoplastic effector)，激活PTI。这两道防线共同构成了植物的先天免疫系统 (Jones and Dangl, 2006)。克隆这些植物免疫受体一方面可以让人们更好的了解植物免疫系统，另一方面也可以将这些免疫受体应用到作物的抗性改造和培育中，从而实现作物病害的有效防控。

随着测序技术的快速发展，为了能更快速、经济的克隆植物抗病基因，很多富集测序的技术被开发出来, 比如抗病基因富集测序 (Resistance gene enrichment sequencing, RenSeq) (Jupe et al., 2013) 、结合了三代测序的PacBio RenSeq (Witek et al., 2016)和结合了关联分析的Association genomics RenSeq (AgRenSeq) (Arora et al., 2019)等等。但是这些富集测序的方法都只关注胞内的NBS-LRR蛋白。

这里，作者以马铃薯-致病疫霉（Phytophthora infestans）作为模式，开发了一套快速鉴定和克隆植物膜上免疫受体（RLP和RLK）的方法。 其中第一步是通过效应子组学(Effectoromics)的方法，将致病疫霉的胞外效应子(apoplastic effector)克隆进PVX (potato virus X)载体，然后通过农杆菌介导的方式在不同的野生马铃薯上进行高通量的筛选，而携带对应膜上受体的野生马铃薯会识别效应子进而出现细胞坏死的表型。在这个研究里，作者筛选了两个胞外效应子，INF1和SCR74，其中INF1的受体ELR已经被克隆 (Du et al., 2015)，在这里用作阳性对照，而SCR74的受体未知。

之后，作者选择了两个高度杂合的二倍体野生马铃薯基因型GIG362-6和MCD360-1进行杂交，得到了F1群体分离群体，其中 GIG362-6可以识别SCR74，而MCD360-1可以识别INF1。 杂交的F1群体对SCR74和INF1的响应独立的以1：1的比例分离，这表明两个受体在各自的亲本里都是被单一显性的基因控制。这里，通过效应子进行表型筛选的优势是可以在一个群体里克隆多个基因。而传统的抗病基因克隆通常通过抗病表型计算分离比，如果有多个抗病基因同时存在的话，需要进行多次杂交，自交或者测交将它们分开。

Figure 3. F1 群体对SCR74和INF1的响应独立以1：1分离。

接下来，作者根据马铃薯参考基因组(Xu et al., 2011)以及一个野生马铃薯M6的基因组 (Leisner et al., 2018)，预测了其中533 个RLK 基因和444个RLP基因，除了典型的LRR-RLK和LRR-RLP，这里还包括了70个带有WAX或者WAX-EGF 结构域的RLK 基因, 38 个带有malectin 结构域的RLK, 11个带有antifungi结构域的RLK, 6 个带有ANK repeat结构域的RLK, 11个LysM RLKs, 24个 L-LecRK, 103个 G-LecRK, 1 个C-LecRK 和22 和其他类型的带有跨膜结构的RLKs。作者设计并合成了RNA 诱饵文库, 然后根据表型对两个亲本以及F1群体根据表型进行混池建库（SCR74响应, SCR74无响应, INF1响应，INF1无响应），富集，然后测序。INF1受体ELR作为对照，该方法成功的将其定位到了12号染色体。

同时，作者将未知的SCR74受体定位到了9号染色体。之后，作者把RLP/KSeq得到的SNP转换为分子标记，并用LightScanner对F1群体进行基因分型。成功的验证了通过RLP/KSeq得到的SNP标记，将SCR74受体定位到了9号染色体的一个5.99Mb的区域。然后，作者扩大了群体，并通过RLP/KSeq和其他分子标记，对SCR74受体进行精细定位。最后，作者建立了GIG362-6的BAC文库，并筛选到了在目标区段的BAC克隆。将SCR74受体定位在了一个43-kbp的G-LecRK位点。

Figure 1. RLP/KSeq的流程

本研究由荷兰瓦赫宁根大学和研究中心（Wageningen UR）植物育种组(Plant breeding) 的Dr. Vivianne G.A.A. Vleeshouwers 团队和苏格兰The James Hutton研究所的Dr. Ingo Hein团队合作完成，第一作者为荷兰瓦赫宁根大学的林啸 (Xiao Lin)博士，现为英国The Sainsbury Laboratory博士后。该研究由荷兰NWO (NWO-VIDI grant 12378) 资助，中国留学基金委公派留学项目以及COST SUSTAIN的短期学术交流项目(Short Term Scientidic Mission, STSM)均提供了资助和支持。