《AM》：首创AIE点无创3PF显微成像技术，实现活体脑卒中过程可视化

来源：高分子科学前沿

原标题：唐本忠院士/梁国栋/钱骏《AM》：首创AIE点无创3PF显微成像技术，实现活体脑卒中过程可视

背景介绍

血管系统是循环系统的关键组成部分，应用荧光纳米探针对活体脑血管进行可视化研究对了解常见的脑部疾病具有重要意义。双光子荧光（2PF）显微镜由于其传统的近红外激发和低的光漂白倾向，通常被用于体内深层组织成像。

然而，即使借助于颅窗，由于生物基质中激发光束的光散射，2PF成像通常也仅限于浅层深度成像。此外，由于整体颅骨永久性丢失，导致术后动物存活率低。自然环境的扰动和脑组织的炎症是不可避免的破坏性干扰，导致成像质量的降低。因此，用无创的方法观察自然环境中的脑是研究脑疾病的理想方法。

为了解决上述问题，三光子荧光（3PF）显微成像作为一种有效的成像方式正在迅速发展。与传统的2PF成像不同，3PF成像技术利用近红外区域（1000-1700nm）的高阶非线性局域激发，显著提高了穿透深度、时空分辨率和信背景比（SBR）。尽管有这些优点，3PF成像的一个主要限制是缺乏具有大的三光子吸收截面和高荧光量子效率的有机染料。

最近，香港科技大学唐本忠院士、中山大学梁国栋副教授和浙江大学钱骏教授合作在《Advanced Materials》上发表了题为“Facile Synthesis of Efficient Luminogens with AIE Features for Three‐Photon Fluorescence Imaging of the Brain through the Intact Skull”的文章，报道了他们在3PF成像有机染料方面的进展。他们通过简单的反应路线合成了具有显著聚集诱导发射（AIE）特性和高量子产率（42.6%）的固体发光材料。合成的BTF分子具有超亮的远红/近红外发射，可以通过简单的纳米沉淀工艺制备成AIE点。AIE点具有高亮度、大的Stokes位移、良好的生物相容性、良好的光稳定性和大的三光子吸收截面，可以作为一种有效的荧光纳米探针，通过三光子荧光显微成像技术对完整的颅骨进行活体脑血管成像。

这是第一个使用AIE点通过完整小鼠颅骨来可视化脑卒中过程的例子，且具有高穿透深度和良好图像对比度。这些良好的结果有望为开发用于活体脑的无创生物成像、具有强非线性光学效应的高效发射体开辟一个新的途径。图文导读

1.AIE发光剂的分子设计与性能作者设计了AIE发光剂BTF，它具有强电子供体三苯胺（TPA）、叔丁基（t-Bu）基团和电子受体富马腈（FN）。BTF具有供体-受体（D-A）结构，使分子具有FR/NIR发射和明显的多光子吸收。此外，BTF还含有更多可自由旋转的苯环和t-Bu基团，有利于通过分子内运动消耗溶液态的激发态能量。这些运动被限制在聚集态，这使得激子能够辐射衰减以促进AIE过程。此外，扭曲的TPA部分和BTF的庞大t-Bu基团阻碍了强π-π堆积相互作用的形成。这些因素使BTF具有长波长发射和高量子效率。BTF在常见有机溶剂中具有良好的溶解性，但不溶于水。为了研究聚集和溶剂极性对BTF发射过程的影响，他们测量了不同水含量（fw）的THF/水混合物的PL光谱。BTF在纯THF中发出微弱的荧光（图1C）。当在BTF的THF溶液中加入少量水（fw≤50%）时，由于典型的扭曲分子内电荷转移（TICT）效应，BTF的发射减弱。在极性环境中，这些分子经历从供体到受体部分的快速分子内电子转移，分子内D–A构象从共面结构转变为扭曲构象。随着水含量的进一步增加（fw≥60%），BTF分子由于疏水作用而形成纳米聚集体。纳米聚集体中的疏水环境缓解了TICT效应，使AIE效应作为主导因素更加明显，导致BTF混合物的PL强度增加。当fw = 90%时，PL强度达到最大值，是纯THF溶液的5倍(图1D)。因此， BTF是AIE活性分子。纯THF溶液中BTF的荧光量子效率（ΦF）为2.7%，在固态下显著提高到42.6%。
图1 A）BTF的化学结构和B）合成途径。C）不同水分数（fw）的四氢呋喃/水混合物中BTF的PL光谱。D）相对PL强度（I/I0）与BTF的THF/水混合物组成的关系图。插图：BTF粉末在365nm紫外线照射下的荧光照片。2.生物成像应用聚集体态BTF具有高ΦF的FR/NIR发射，可以用于生物成像。为了使疏水性BTF在水介质中具有良好的水分散性，采用两亲性聚合物Pluronic F-127作为生物相容性的封装剂来制备BTF点（图2A）。在水溶液中，Pluronic F-127和AIE分子的亲脂部分形成纳米点核，亲水部分伸入水中形成外壳。BTF点在水溶液中的最大吸收波长为500nm，与515nm的商业激光激发非常吻合。BTF点的PL光谱在红色区域（645nm）处达到峰值，并很好地延伸到近红外区域（800nm）。BTF点比传统有机染料（通常<25nm）具有更大的斯托克斯位移（>130nm），这有利于高对比度生物成像应用，因为自吸收的发射猝灭倾向较小。BTF点的荧光量子产率（ΦF）为36.1%。BTF点具有长期稳定性。即使它们在磷酸盐缓冲液（PBS）中的悬浮液在室温下保存很长时间，它们的荧光光谱几乎保持不变。而且BTF点的细胞毒性较低。在不同浓度（12.5、25、50和100mg mL-1）下与HeLa细胞孵育24小时后，细胞活力均保持在95%以上。BTF点具有较高的化学稳定性。将BTF点分散在不同的pH值的缓冲溶液下，未检测到UV和PL的明显变化。他们继续研究了BTF点的非线性光学特性。在1550nm的近红外飞秒（fs）激光激发下，三个1550nm的光子在激发过程中同时被吸收，随后发生与单光子过程相同的辐射衰减过程（图2B）。在约650 nm处观察到BTF点的明亮3PF，并在517 nm处观察到来自三次谐波产生（THG）的尖锐信号峰（图2B，C）。3PF和THG都是高阶非线性光学效应。3PF最大发射波长位于650nm 的FR/NIR区域，它具有较高的穿透深度和较低的光吸收，所以BTF点的强3PF更适合于活体生物成像。在1550nm处，BTF的三光子吸收截面σ3为2.56×10-79cm6 s2，远高于常用有机染料Rh6G（6×10-81 cm6s2）和一些先前报道的染料。BTF点的较高σ3值有利于深层组织生物成像。图2 A）使用F127作为聚合物基质的BTF点的形成过程的图解。B）1PF、3PF和THG过程的示意图。C）1550nm飞秒激光激发下BTF在水分散体系中的非线性光学性质。插图：毛细管内BTF水分散体的THG和3PF图像。D）1550nm飞秒激光激发下BTF点荧光强度与功率的关系。E）1550nm连续激光辐照下不同时间点BTF点的3PF强度。他们首先研究了使用3PF成像系统通过小颅窗对小鼠脑血管进行实时成像。如图3A-C所示，3PF和THG信号匹配良好，这表明它们来自同一个纳米探针。3PF和THG成像模式的结合提高了深部组织成像的可靠性。图3D-F显示了从0到900μm的不同穿透深度的小鼠大脑的三维高分辨率血管重建图像。通过组合不同穿透深度的图像（图3J），从不同的视角（图3K，L）重建高分辨率三维图像，提供了关于主要血管网络和微小毛细血管细节的清晰空间图像。图3 穿透深度为55μm的小鼠脑血管的A）THG、B）3PF和C）叠加图像。D−F) 小鼠大脑血管穿透深度从0到900µm的体内三维高分辨率图像。G,H)沿(D)和(E)中蓝线测量的截面强度剖面。I)荧光信号衰减曲线。J)不同穿透深度的脑血管荧光图像。小鼠大脑的血管穿透深度从0到900µm的3D图像K)侧视图和L)顶视图。他们进一步将荧光BTF点应用于具有完整颅骨的小鼠脑血管可视化。图4A-C显示了小鼠脑血管的三维高分辨率重建图像，该图像提供了主要血管系统和微小毛细血管网络的清晰空间图像。所示微毛细管的半高宽在200μm深度处计算为0.95μm，在300μm深度处计算为1.59μm，在400μm深度处计算为2.08μm（图5D-F）。脑血栓形成是一种常见的脑部疾病，可导致急性脑损伤甚至死亡。因此，他们进一步利用BTF纳米点来监测完整颅骨小鼠的脑卒中过程。首次利用AIE点对颅骨完整的小鼠大脑进行3PF成像，利用红外减反射低倍物镜获得大视场血管结构的一般信息（图4G，H）。在正常脑状态下，可有效监测到来自血管的高达92.1的强3PF信号。脑血栓形成后，3PF强度显著降低至1.1的低值，与背景信号难以区分。基于具有显著非线性光学效应的超亮AIE点，他们首次以高对比度无创性地观察了颅骨完整的活体小鼠脑血栓形成过程（图4L）。图4 A-C）具有完整颅骨的小鼠脑血管的活体三维高分辨率图像，穿透深度为0至400μm。D–F）沿（A）–（C）中黄线测量的横截面强度剖面。脑血栓形成前（G，H）和后（I，J）脑血管的G-J）3PF图像。K）沿（G）和（I）中黄线测量的横截面强度剖面。L）利用3PF显微成像技术，基于AIE点的完整颅骨脑血栓形成过程可视化示意图。亮点小结综上所述，作者合成了明亮的AIE发光剂BTF，粉末状态具有高达42.6%的量子效率。所得的AIE点具有高亮度、大Stokes位移、良好的生物相容性、良好的光稳定性和大的三光子吸收截面。它们可以作为高效荧光探针，用于高穿透深度和图像对比度的近红外激光激发活体脑血管成像。首次报道用AIE点无创3PF显微成像技术观察小鼠脑卒中过程。这些良好的结果将有助于开发高效的固态近红外发射器，用于无创监测大脑疾病或功能紊乱。

作者：Yet  究方向）