针对不同肿瘤样本的单细胞/单细胞核RNA-seq工具包

来源：BioArt

肿瘤微环境是恶性细胞和非恶性细胞组成的复杂细胞生态环境，其多样性和细胞间相互作用影响癌症的进展、药物响应和耐药性。单细胞基因组学，特别是单细胞RNA-seq（scRNA-seq）增加了我们对肿瘤分析的能力，可揭示出肿瘤复杂生态系统中细胞类型、状态、遗传多样性和相互作用【1-2】。但对临床肿瘤样本进行scRNA-seq需要克服几项困难：1）根据肿瘤类型不同，选择合适的快速分散和酶消化方法，这会导致敏感型细胞的缺失或基因表达改变；2）得到新鲜的肿瘤组织后需要立刻进行组织处理和实验，但临床上获取新鲜的肿瘤组织具有时间限制性。单细胞核RNA-seq（snRNA-seq）可以对冷冻组织的细胞核进行测序分析，可解决组织获取时间限制性和组织处理的即时性，但细胞核的mRNA含量比细胞低，可能难以富集或几乎无法得到感兴趣的细胞类型。3）由于不同肿瘤中细胞成分和细胞外基质的不同，scRNA-seq和snRNA-seq在应用时，需要根据肿瘤类型进行合适的改进。

近日，Broad研究所的Aviv Regev和Orit Rozenblatt-Rosen团队合作在Nature Medicine上发表了题为A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors 的文章，开发出分别用于处理新鲜肿瘤组织和冷冻肿瘤组织的scRNA-seq和snRNA-seq的系统化工具包，工具包中包含了实验流程和方法、计算过程和评估指标。为了对比肿瘤和样本类型，对8种类型的不同组织特征的23个肿瘤样本进行测试，分析了216490个细胞及40个样品的细胞核信息，包括来自同一肿瘤样本的新鲜和冷冻状态的比较。这一工具包可为多种肿瘤类型提供最佳方案，有助于研究人员根据研究目标选择最合适的方案，并指导如何为新的肿瘤和样本类型定制方案。

为了研发根据肿瘤类型定制化的sc/snRNA-seq工具包，研究人员对8种具有不同组织特征的肿瘤类型进行研究，其中涵盖了不同细胞来源（如上皮细胞、神经细胞）、实体瘤和非实体瘤、病人的年龄和转变（如原位和转移）等因素，肿瘤的种类包含非小细胞肺癌（NSCLC）、转移性乳腺癌（MBC）、卵巢癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤（GBM）、儿童高级胶质瘤、慢性淋巴细胞白血病（CLL）、儿童肉瘤和黑色素瘤。研究对23个肿瘤样本进行测试，得到了216490个细胞及40个样品的细胞核信息。根据细胞/核质量、数据恢复的细胞数与预期的细胞/核数量、细胞组成等指标，开发了使用积云（Cumulus，一种基于云的数据分析框架）进行初始数据分析和一个用于质控分析、肿瘤样本特征和实验方法对比的工作流程。

对于5种新鲜肿瘤（NSCLC、卵巢癌、MBC、神经母细胞瘤、GBM和冷冻保存的CLL）样本的处理过程进行优化，构建工作流程，以便于将临床组织样本获得和分散成细胞之间的时间间隔最小化，以最大程度地保持细胞活性和RNA图谱的稳定性。对于组织消化过程，根据每种肿瘤类型的具体特征，如细胞类型组成和细胞外基质成分，并结合文献报道和处理类似人或小鼠组织的经验，选择相应的酶混合物对新鲜组织进行处理。例如使用Liberase TM分解乳腺癌的胶原纤维，使用木瓜蛋白酶分解GMB的细胞外基质，同时使用DNA酶I消化死亡细胞释放的DNA，降低分离混合物的粘度。而肿瘤组织处理过程的优化方案中需要考虑对测序结果的细胞类型特异性和细胞组成等质控指标的影响。例如，NSCLC组织样本可使用3种消化方案：1）胶原酶4（NSCLC-C4）；2）PDEC酶混合物（pronase、dispase、elastase和collagenases A/4）；3）LE酶混合物（Liberase TM和elastase），分别与DNase I结合使用。所有方法都记录到的具有高质量表达谱、双重液滴、恶性细胞CAN模式的细胞数目类似，但只有PDEC和LE方法记录到成纤维细胞和内皮细胞，NSCLC-C4中“空液滴”（仅包含环境RNA）比例高出100倍，而“空液滴”位于巨噬细胞亚群中。清除肿瘤组织中免疫细胞（可使用anti-CD45的MACS磁珠）可有效富集恶性细胞和基质细胞，NSCLC肿瘤在免疫细胞清除前后，scRNA-seq中恢复的上皮细胞比例分别为26%和82%。此外，研究人员证实scRNA-seq工具包可用于不同解剖部位的临床活检样本和治疗后样本。

对于实体瘤冷冻样本的snRNA-seq，研究人员在神经母细胞瘤、MBC、卵巢癌、儿童肉瘤、黑色素瘤、儿童高级胶质瘤和CLL中对比几种核分离方法：1）EZPrep；2）NST（Nonidet P40、盐和Tris）；3）CST（CHAPS、盐和TRIS）；4）TST（吐温、盐和Tris）。经过对比发现，TST、CST、NST三种方法分离的核质量类似，但TST方法产生的细胞类型多样性最大、每种细胞的核数目最多、线粒体基因表达最高，NST产生的细胞核中基因最少、细胞类型多样性最低。TST可适用于大多数肿瘤类型，CST可适用于神经组织，如儿童高级胶质瘤。使用同样的样本进行scRNA-seq和snRNA-seq对比，发现两种方法记录的细胞类型类似，但比例存在差异。例如，神经母细胞瘤和MBC中，scRNA-seq中免疫细胞比例更高，而scRNA-seq中实质性细胞（特别是恶性细胞）比例更高。所有被测试的肿瘤类型中，细胞和细胞核可通过典型的相关性分析和细胞类型分组进行批量校正。将scRNA-seq和snRNA-seq记录的新鲜组织细胞和冷冻组织细胞核中表达模型进行对比分析，探究“分离信号（消化过程）”对细胞/细胞核的影响。分离信号在细胞的检出率远高于细胞核，尤其是实体瘤中。在细胞和细胞核测序中，分离信号在免疫细胞如T、NK、巨噬细胞等和基质细胞如成纤维细胞和内皮细胞中更为突出，这有可能是实质细胞分离损伤释放的信号所致，也有可能是免疫激活和早期反应的信号。

总之，研究进一步开发并完善了scRNA-seq和snRNA-seq在肿瘤组织中应用的工具包，为多种类型肿瘤研究提供指导，同时提供从工具包中为其他类型的肿瘤选择测试和方法的标准，为绘制肿瘤图谱提供资源。